PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

作     者：黄玉民 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：石亚伟

授予年度：2009年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：PICK1 AMPAR Ca2+ PDZ结构域 BAR结构域 酸性区域 

摘      要：在神经系统中,AMPAR型受体调节大多数兴奋性突触传递,因此调节突触上AMPAR的数量或功能很可能是学习与记忆的细胞生物学机制。学习与记忆主要涉及中枢神经系统的长时程变化,这种时程性变化表现为长时程增强(LTP)或长时程抑制(LTD)两种现象。长时程增强(LTP)主要通过胞外分泌插入额外的AMPAR到细胞质膜表面增强突触强度;而长时程抑制(LTD)主要内吞质膜表面的AMPAR从而减弱突触传递。PICK1(protein interacting with Cαkinase)蛋白是细胞内AMPAR循环的关键调节者。PICK1是一类存在于细胞质中的膜结合蛋白,是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)的靶蛋白之一,也是连接激酶和膜上受体的一个衔接蛋白。小鼠来源的PICK1由416个氨基酸残基组成,包含PDZ结构域、BAR结构域和酸性氨基酸区。PDZ结构域被认为是其中的主要调节蛋白-蛋白相互作用的片段,包括受体蛋白、转运蛋白等,PICK1的BAR结构域也可与其它蛋白相互作用,如GRIP,NSC-1等,同时BAR结构域还能够识别和诱导膜的弯曲,这些相互作用在AMPAR受体循环形成过程中起到重要的作用;而对PICK1的酸性区域在AMPAR循环中可能的作用还不太清楚。 Ca是细胞内的重要的离子,细胞内外钙离子浓度水平的改变是调节诸如肌肉收缩、激素和神经递质释放、离子运输、细胞生长和分化等众多生理生化过程的重要因子,钙离子在神经活动中,在AMPAR的循环过程中也起着关键性的调节作用。本文对酸性区域以及钙离子通过与酸性区域的结合对PICK1蛋白在AMPAR的循环中的作用进行了体外分析。 通过基因克隆,重组蛋白的体外表达,以及利用亲和纯化、分子排阻层析,获得了PICK1截短的N-PDZ(1-110残基),PDZ(20-110残基),BAR(128-360残基)和BAR-C(128-416残基)重组蛋白。在此基础上利用荧光光谱技术,通过内、外源荧光检测试验,分析了C端酸性区域对其蛋白脂质结合能力和“分子开关的构象状态的影响,同时对钙离子的调节作用进行了研究;又通过酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白-脂质覆盖法(PLO)对上述试验进行了验证。 通过试验表明,Ca通过与PICK1蛋白C端酸性区域的结合,参与调节BAR结构域与脂膜,BAR与PDZ间的相互作用。C端酸性区域对前者起到负调节作用而对后者却表现为正调节,钙离子通过与C端酸性区的结合,对两种作用作出相反的二次调节。 通过对PICK1蛋白酸性区域以及钙离子调节作用在AMPAR循环中影响的分析,为我们了解PICK1的性质,认识PICK1在神经生命活动中的“桥梁作用提供了新的思路。