产肠毒素大肠杆菌溶血素HlyA的原核表达、多抗制备及相关功能探析

作     者：杨样 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱国强

授予年度：2015年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 090601[农学-基础兽医学] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：K88ac+ETEC 溶血素HlyA 原核表达 多克隆抗体 OMV 黏附 细胞毒性 

摘      要：产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是一种重要的食源性致病菌,可引起人或幼畜(初生羔羊、犊牛及断奶仔猪)的腹泻,是断奶仔猪腹泻的主要病原菌,其高发病率和高死亡率的特点给养殖业造成严重的经济损失。K88ac+ETEC血清型为国内初生及断奶仔猪腹泻的优势血清型,其主要毒力因子包括黏附素菌毛、肠毒素、内毒素、水肿病毒素、溶血素等。ETEC的黏附素菌毛、不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)、耐热性肠毒素(Heat-stable enterotoxin, ST)等毒力因子受到广泛关注,但作为尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage Escherichia coli, EHEC)重要毒力因子的溶血素在ETEC致病机理中的功能却鲜有报道,故本研究选择K88ac+ETEC作为试验对象,初步探究溶血素在ETEC致病中的作用。通过PCR方法扩增负责表达大肠杆菌C83902溶血素亚单位HlyC、HlyA的基因hlyC, hlyA,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET-28a(+)-hlyCA,经酶切验证、测序,确定质粒的成功构建。将重组质粒转化至*** BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导和Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白HlyA。纯化后的重组蛋白用两种方法免疫新西兰白兔,获得特异性较高的兔源抗HlyA多克隆抗体血清。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白HlyA,经免疫后成功获得兔源HlyA抗体,为进一步探究大肠杆菌溶血素HlyA的生物学功能及致病机理奠定基础。利用ETEC标准株C83902、已构建的溶血素hlyA基因缺失株C83902A hlyA和回补株C83902A hlyA/phlyA,通过荧光定量PCR从转录水平研究溶血素与ETEC其他重要毒力因子的关系,初步探索了溶血素在细菌胞外的存在形式,并对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞系进行了粘附和粘附抑制试验、细胞形态学观察、细胞毒性试验等一系列功能性探索。Real-time PCR试验结果表明溶血素的缺失使得sepA(编码丝氨酸蛋白酶主要结构亚基)的转录水平上调了83%(p0.01),fimH(编码Ⅰ型菌毛主要结构亚基)和eltB(编码热不稳定肠毒素主要结构亚基)分别下调约40%和21%(p0.01),faeG(编码K88菌毛主要结构亚基)显著下调了约24%(p0.05),而对fliC(编码鞭毛丝蛋白主要结构亚基)的转录无显著影响。上述结果表明溶血素与丝氨酸蛋白酶可能存在相互调控机制,且溶血素的表达可能与细菌对宿主细胞的黏附有关。对外膜囊泡(outer membrane vesicle, OMV)及溶血素进行分离鉴定后,发现溶血素除游离形式存在外,还能以与外膜囊泡结合的形式存在于细菌上清中,验证了外膜囊泡可以作为溶血素运输载体的假说。IPEC-J2的细胞黏附与黏附抑制试验结果表明溶血素缺失株组的细菌粘附数量为野生株组的2.13倍(p0.01),细胞形态学观察发现细胞经溶血素作用后形态变圆变小,且细胞毒性试验结果表明溶血素可引起细胞死亡,综合IPEC-J2细胞的各项试验可以说明溶血素对仔猪空肠上皮细胞具有细胞毒性,且可能降解细胞间连接蛋白,因而引起上皮细胞脱落从而使得细菌可以从肠道排出,这种排菌机制理论与溶血素缺失株细菌黏附数量提高的试验结果相一致。