DON模拟表位的两种表达载体的构建及应用研究

作     者：徐富勇 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘仁荣

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：脱氧雪腐镰刀菌烯醇 模拟表位 ELISA 噬菌体展示系统 融合蛋白 

摘      要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)是一种由镰刀菌产生的霉菌毒素,由于DON对人及动物具有致畸作用、细胞毒性及免疫毒性等危害,因此其污染对人类和动物的安全构成了严重的威胁。 目前,DON的分析检测方法主要包括高效液相色谱法、薄层色谱法、液相-质谱联用法等。但这些方法都耗时耗力、操作复杂。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种以免疫化学为基础的检测方法,它具有灵敏度高、检测快速和操作简便等特性。但是,常规ELISA检测方法需要使用DON标准品偶联载体蛋白制备竞争抗原,存在DON标准品购买成本高和对检测操作人员的健康有害等缺陷。因此,寻求一种能够代替DON进行ELISA检测的物质显得非常有必要。DON模拟表位(CMRPWLQ),简称CDON,能够替代天然抗原与抗DON抗体相结合,且DON模拟表位具有无毒及廉价等特性。因此,DON模拟表位的高效表达给以上问题提供了一条新的解决途径。本研究构建了两种表达载体,并以之表达了二种CDON的融合蛋白,使用ELISA方法检测两种融合蛋白的反应原性,建立了DON的无毒ELISA检测方法。主要结果如下： 1.将含有DON模拟表位(CMRPWLQ)及BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的T11T12寡核苷酸双链克隆至pGEX-4T-1质粒,构建出了pGEX-4T-1-CDON重组质粒。将含有DON模拟表位(CMRPWLQ)及BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的T13T14寡核苷酸双链克隆至pC89S4噬菌粒,构建出了重组噬菌粒pC89S4-CDON。 2.将pGEX-4T-1-CDON转化感受态BL21(DE3),得到工程菌pGEX-4T-1-cdon,对诱导时间、温度、加入IPTG时菌体浓度及IPTG的量进行了优化。得出最优条件为当菌体浓度达到0.6时加入IPTG至终浓度为1mM,于25℃诱导表达6h。超声破碎菌体,利用GST-resin纯化系统得到97%纯度的融合蛋白。 3.将pC89S4-CDON转化感受态XL1-Blue,得到工程菌pC89S4-cdon。通过丝状噬菌体pⅧ展示系统表达出了展示有高密度DON模拟表位的重组噬菌体,对诱导时间、温度、辅助噬菌体KM13超感染是菌体浓度、加入IPTG时菌体浓度及IPTG的量进行优化。噬菌体展示DON模拟表位融合蛋白pⅧ-CDON的最佳条件为：当菌体浓度达到0.3时加入KM13超感染,继续培养至OD600达到0.6时,加入IPTG至终浓度为1mM,于25℃诱导表达8h,纯化得到2.04mgpⅧ-CDON融合蛋白。 4.使用ELISA方法比较了两种表达载体表达的GST-CDON和pⅧ-CDON融合蛋白与抗DON抗体的反应原性,使用间接竞争性ELISA方法绘制标准曲线,进行了DON加标回收试验,建立了DON的无毒ELISA检测方法。