精氨酸脱亚氨基酶基因克隆及在大肠杆菌中表达

作     者：茅立华 

作者单位：南京理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李大力

授予年度：2005年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：精氨酸脱亚氨基酶 基因克隆 表达 瓜氨酸 

摘      要：瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸,它在生物体内氨的代谢中起着重要作用,在医药、化妆品等领域也有重要应用。酶法生产瓜氨酸是目前最有优势的生产方法。精氨酸脱亚氨基酶(ADI)催化精氨酸亚胺水解,产生瓜氨酸和氨,是酶法生产瓜氨酸的催化剂。采用分子生物学方法克隆精氨酸脱亚氨基酶基因并进行原核表达,是获得精氨酸脱亚氨基酶的有效方式。 提取恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)的DNA,PCR扩增精氨酸脱亚氨基酶基因,通过分子生物学方法将此基因片段插入pET-30a和pBV220,并转化BL21(DE3)和JM109感受态细胞,得到两株基因工程菌BL21(DE3)(pET-30a-cit)和JM109(pBV220-cit)。将BL21(DE3)(pET-30a-cit)质粒进行测序,测序结果与GenBank中Pseudomonas putida ATCC 4359进行同源性比对,DNA序列的相似度为90%,所编码的蛋白的氨基酸序列相似度为100%。 用0.1%IPTG诱导BL21(DE3)(pET-30a-cit)精氨酸脱亚氨基酶的表达,超声波破壁使酶释放,检测到BL21(DE3)(pET-30a-cit)每毫升发酵液中精氨酸脱亚氨基酶的酶活为235.7U。用42℃热激诱导JM109(pBV220-cit)精氨酸脱亚氨基酶的表达,但是未检测到酶活。SDS-PAGE检测到BL21(DE3)(pET-30a-cit)所表达蛋白的分子量约为43kDa。