内源性绵羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表达

作     者：苏佳 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马学恩

授予年度：2011年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：内源性绵羊肺腺瘤 内源性env基因 克隆 原核表达 

摘      要：研究背景:内源性绵羊肺腺瘤病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovirus ,enJSRV)序列与外源性绵羊肺腺瘤病毒序列密切相关。在绵羊肺腺瘤病的发病过程中,虽然enJSRV不对OPC的发生有直接地致瘤作用,但是在正常羊的个体发育过程中,enJSRV的表达可能会对exJSRV的感染和OPA(Ovine pulmonary adenomatosis)疾病的发生有影响。 实验目的:克隆内源性绵羊肺腺瘤病毒的env基因,将内源性env基因重组进入原核表达体系中,尝试诱导内源性env基因进行原核表达。为制备内源性env基因多克隆抗体奠定基础。 研究方法:参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与3’长末端重复序列保守区序列设计引物,以正常地绵羊肺脏基因组为模板,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤env基因与3’长末端重复序列;将克隆的内源性env基因通过相应的酶切位点,亚克隆到原核表达载体pET-32a中,再转化入大肠杆菌BL21中后用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE分析内源性env基因编码的蛋白表达并应用Western-Blotting鉴定。用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白并应用Western Bloting鉴定。 实验结果表明:利用PCR成功扩增内源性env基因与3’长末端重复序列,测序得目的片段长度为2249bp,与预期片段长度一致;内源性env基因在原核表达体系中可以少量表达,其原核表达蛋白的表观分子量为89kDa;对内源性env基因编码表达的蛋白质经Western-Blotting鉴定,实验成功表达内源性env基因编码的蛋白;用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白,通过Western Bloting鉴定表明纯化结果仅有一条带。 综上所述,在我国,此次实验首次克隆了内源性env基因,并将内源性和外源性env基因进行比较。尝试表达内源性env基因编码的蛋白质,为进一步研究env基因在绵羊肺腺瘤疾病的感染,疾病发生、发展中,以及内源性env基因在正常动物体内的生理功能与所起作用奠定小小的基础。