FBW7泛素化修饰Snail抑制NSCLC转移的实验研究

作     者：张勇 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张艰;张健

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：FBW7 EMT Snail 肿瘤侵袭转移 

摘      要：作为泛素连接酶SCF复合体中的一种F-box分子,FBW7(F-box/WD repeat-containing protein 7)在调控细胞周期、细胞增殖、分化、凋亡和转移等细胞生物学过程中起到重要作用。FBW7在人体组织内广泛存在。FBW7作为重要的抑癌蛋白参与多种细胞生理和病理活动。FBW7表达含量的降低可促使某些癌蛋白不能被降解继而引起细胞和组织正常功能的变化,诱导癌症的发生。这一现象在许多不同类型肿瘤中广泛存在。此外,FBW7表达降低可促使某些肿瘤发生远处转移。由此可见,作为抑制癌症发生发展的新兴靶点,在一定范围内提高体内FBW7表达水平可能在延缓癌症进展和避免肿瘤晚期转移等方面发挥关键作用。本实验从肿瘤侵袭转移角度入手,以NSCLC为研究对象,探讨FBW7在参与转录抑制因子Snail蛋白的泛素化修饰和降解过程并抑制上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤转移的机制研究。第一部分:目的:明确NSCLC组织中FBW7的表达水平,探索FBW7在正常肺组织和NSCLC中的表达差异,从组织水平研究FBW7与NSCLC在转移作用中的相关性并从EMT角度阐释FBW7在肺癌中引起转移的作用。方法:通过临床数据库分析FBW7在NSCLC中的表达差异和突变类型,将组织芯片进行免疫组织化学染色明确FBW7的表达情况,在NSCLC样本中通过Western blot方法检测FBW7和E-cadherin的表达水平并进行统计学分析。结果:FBW7基因在mRNA水平的变化主要集中于NSCLC中的腺癌,其变异程度呈多样性,但以点突变为主;FBW7高表达患者总生存期(overall survival,OS)和无进展生存期(progression free survival,PFS)均较FBW7低表达患者明显延长;患者肿瘤组织标本中的FBW7表达水平较其正常肺组织明显降低;肿瘤组织内FBW7表达水平明显高于肿瘤组织,作为上皮间质转化的标志物之一的E-cadherin的变化与FBW7表达一致且两者间存在相关性。结论:FBW7可作为抑癌基因在细胞组织内发挥作用,其表达增高提示良好的远期预后,患者的OS及OFS较FBW7低表达患者显著延长;肿瘤组织中FBW7蛋白表达明显低于正常肺组织,且FBW7表达的变化可能是引起肿瘤侵袭转移能力变化的一个重要原因;可将FBW7表达水平作为评价NSCLC患者预后的临床参考指标。第二部分:目的:明确FBW7与Snail间的相关性;FBW7表达降低对细胞侵袭转移能力的影响;下调FBW7表达水平引起细胞侵袭转移能力的变化与Snail蛋白稳定性间的关系。方法:给予FBW7激动剂处理并导入相关质粒从内源性和外源性角度探索FBW7与Snail间的作用关系;获取转基因小鼠MEF细胞并通过下调表达明确FBW7与肿瘤转移之间的关系;构建低表达FBW7的稳定细胞系通过平板克隆形成实验观察细胞形态并经Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化;对小鼠进行尾静脉注射并经小动物成像检测不同FBW7表达水平的肺癌细胞转移能力和细胞成瘤性的影响。结果:在黑色素瘤细胞系中,上调FBW7表达后Snail表达水平降低且其半衰期较正常组明显缩短;提高FBW7表达后Snail蛋白含量明显降低,而给予MG132处理后Snail表达升高;导入Cre质粒后可敲除MEF细胞中FBW7的表达,内源性Snail表达明显升高,间质细胞标记物Vimentin表达上升;A549和H1299肺癌细胞系中Snail呈高表达状态,下调两株细胞FBW7水平可使细胞形态发生变化且侵袭转移能力发生改变;下调FBW7的Lewis肺癌细胞成瘤性和转移能力明显增强。结论:上调FBW7可通过蛋白酶体途径引起Snail蛋白稳定性下降;下调FBW7可引起Snail表达上升,导致EMT过程的发生,使上皮来源肿瘤细胞获得间质细胞特性,并可在体内引起肿瘤转移能力和成瘤性的升高。第三部分:目的:明确Snail氨基酸序列内PEST结构域的保守性;探索FBW7降解Snail的潜在分子机制;研究FBW7与Snail的结合方式和降解作用机制。方法:通过分析不同种属Snail氨基酸序列并分析PEST结构域的保守性;将不通过质粒导入细胞给予蛋白酶体抑制剂处理并通过Western blot方法检测相关分子表达水平;运用co-IP方法研究FBW7与Snail分子间的相互作用关系。结果:Snail蛋白的氨基酸序列中存在PEST结构域,且无种属特异性;随着FBW7表达升高,Snail表达水平下降;与FBW7 FL组相比,FBW7ΔF组Snail蛋白表达升高;内源性和外源性水平证实FBW7与Snail存在相互作用关系。结论:Snail可通过某种方式被磷酸化修饰进而被泛素化降解,且这种作用依赖于FBW7的表达水平和结构完整性,两者间可通过直接的相互作用结合实现Snail蛋白的降解。因此,临床工作中可将FBW7作为评价患者预后的指标之一,FBW7可通过与Snail的直接结合并进行泛素化修饰和降解抑制上皮间质转化过程,进而抑制NSCLC的侵袭转移作用。在一定范围内提高FBW7表达可抑制晚期NSCLC患者远处转移并提高患者无进展生存期和总生存期。FBW7可能成为临床预防和治疗NSCLC侵袭和转移的新靶点。