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FBW7 increases chemosensitivity in hepatocellular carcinoma cells through suppression of epithelial-mesenchymal transition

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Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International 2014年第2期13卷 184-191页

作者： Jun Yu Wu Zhang Feng Gao Yuan-Xing Liu Zhi-Yun Chen Long-Yu Cheng Shang-Fen Xie Shu-Sen Zheng Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery the First Affiliated HospitalZhejiang University School of Medicine Key Laboratory of MultiOrgan Transplantation of Ministry of Public Health

BACKGROUND: FBW7 is a tumor suppressor which regulates a network of proteins with central roles in cell division, cell growth and differentiation. This study aimed to evaluate the role of FBW7in chemosensitivity and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in different hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and to investigate the relevant underlying mechanisms.METHODS: Different human HCC cell lines (Hep3B, Huh-7,and SNU-449) were cultured. The cell viability was evaluated by cell counting kit-8, and FBW7 mRNA transcription and protein expression were quantitated by real-time PCR and Western blotting. Expressions of vimentin (mesenchymal biomarker)and E-cadherin (epithelial biomarker) were evaluated by Western blotting and immunocytochemistry. Cell invasion was assayed by Transwell migration, and FBW7 plasmid or siRNA was used to evaluate the effect of FBW7 overexpression or silencing on cell chemosensitivity.RESULTS: FBW7 expression affected tumor cell chemosensitivity to doxorubicin and tumor cell invasive capacity in different HCC cell lines. FBW7hi (high FBW7 expression) Hep3B and FBW7mi (median FBW7 expression) Huh-7 cells were more sensitive to doxorubicin and lower in invasive capacity than FBW7lo (low FBW7 expression) SNU-449 cells. Silencing of FBW7in Huh-7 and Hep3B cells induced the resistance to doxorubicin and enhanced cell invasion, whereas overexpression of FBW7in SNU-449 cells restored the sensitivity to doxorubicin andsignificantly reduced invasive capacity. Furthermore, doxorubicin induced EMT toward mesenchyme in HCC cells. Downregulation of FBW7 in Huh-7 and Hep3B cells or upregulation of FBW7 in SNU-449 cells altered the direction of EMT.CONCLUSIONS: The level of FBW7 expression impacted the tumor resistance to doxorubicin and the invasion capability of HCC cells. FBW7 therefore may be a potential target for the chemotherapy of HCC through the regulation of EMT.

关键词： FBW7 hepatocellular carcinoma doxorubicin epithelial-mesenchymal transition drug resistance

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Post-self-repair process of neuron cells under the influence of neutral and cationic nanoparticles

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Chinese Chemical Letters 2019年第12期30卷 2368-2374页

作者： Ting Wang Guanwen Qu Yu Deng Jing Shang Zhangqi Feng Fengyu Yang Nongyue He Jie Zheng State Key Laboratory of Bioelectronics National Demonstration Centre for Experimental Biomedical Engineering EducationSchool of Biological Science and Medical EngineeringSoutheast UniversityNanjing 210096China State Key Laboratory of Natural Medicines Department of PharmacologyChina Pharmaceutical UniversityNanjing 210002China Department of Chemical and Biomolecular Engineering The University of AkronOH 44325United States School of Chemical Engineering Nanjing University of Science and TechnologyNanjing 210094China Nanjing Daniel New Mstar Technology Ltd.Nanjing 2U200 China

The prevalence of functionalized nanoparticles in biological and clinical fields attracts intensive toxicology investigations.Minimizing the nanoparticles’ biohazard remains a challenge due to the insufficient understanding on the nanoparticle-induced cell death mechanism.In the presented study,we observed the lysosome and genome injuries and so caused cell cycle changes and regulations of retinal ganglion neuron cell 5(RGC-5) induced by aminated and alkylated nanoparticles.Alkylated nanoparticles induced malignant lysosome and genome damages followed by severe post-self-repair responses.RGC-5 treated with alkylated nanoparticles presented dramatic S phase prolongation resulted from cyclin E accumulation mediated by FBW7 downregulation,which assisted DNA replication after failed self-repair of the malignantly damaged DNA caused by alkylated nanoparticles.Differently,aminated nanoparticles in RGC-5 induced moderate lysosome and genome injuries and these damages could be repaired in the p21-involved pathway,so that cells did not induce apparent cyclin E accumulation nor FBW7 downregulation as post-self-repair response.These results helped us to understand the toxicity of analogous nanoparticles on retinal ganglions such as glaucoma treatment.This work provides new insights into nanoparticle functionalization and toxicity in relation to the research on the toxicology and pathology of nerve cells.

关键词： Lysosome S phase Cyclin E p21 FBW7

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FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭

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现代肿瘤医学 2021年第16期29卷 2765-2769页

作者：路遥任程王谦马腾孙亮李明李忠周勇姚晓蓉西安交通大学附属红会医院骨科陕西西安710054 空军军医大学附属唐都医院骨科陕西西安710038

目的:观察FBW7在骨肉瘤细胞SOSP-9607中的表达,探讨FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的作用以及与Notch信号通路的关系。方法:培养人骨肉瘤SOSP-9607细胞,用慢病毒介导的siRNA转染SOSP-9607细胞,并分为sh-FBW7组(下调FBW7)、up-FBW7组(上调FB... 详细信息

目的:观察FBW7在骨肉瘤细胞SOSP-9607中的表达,探讨FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的作用以及与Notch信号通路的关系。方法:培养人骨肉瘤SOSP-9607细胞,用慢病毒介导的siRNA转染SOSP-9607细胞,并分为sh-FBW7组(下调FBW7)、up-FBW7组(上调FBW7)和空白对照组。利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印记法(Western blot)验证分析骨肉瘤细胞系SOSP-9607和正常成骨细胞系hFOB中FBW7 mRNA表达和蛋白表达水平。Transwell实验验证FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭作用的影响。Western blot验证FBW7与Notch信号通路的关系。结果:qRT-PCR和Western blot检测结果显示:骨肉瘤细胞系SOSP-9607中FBW7 mRNA表达和蛋白表达明显低于正常成骨细胞系hFOB(PFBW7组的迁移与侵袭细胞数明显高于空白对照组(PFBW7组的迁移与侵袭细胞数明显低于空白对照组(PFBW7可以抑制Notch1及其靶基因Hes1的表达;下调骨肉瘤细胞中的FBW7可以增加Notch1及其靶基因Hes1的表达。结论:FBW7在骨肉瘤SOSP-9607细胞中低表达,FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭。

关键词：骨肉瘤 FBW7 Notch

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泛素连接酶FBW7修饰锌指转录因子对肝癌细胞侵袭转移的影响

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中华实验外科杂志 2020年第6期37卷 1076-1078页

作者：朱云峰余芃杨俭杨家印四川大学华西医院肝脏外科成都610041

目的探讨泛素连接酶FBW7是否在肝癌细胞HepG2中参与泛素化修饰锌指转录因子Snail而影响侵袭和转移。方法通过转染沉默HepG2细胞(购自武汉普诺赛生命技术公司)FBW7的表达48 h后,实验组为沉默FBW7的HepG2细胞,对照组为空白载体转染,分别检... 详细信息

目的探讨泛素连接酶FBW7是否在肝癌细胞HepG2中参与泛素化修饰锌指转录因子Snail而影响侵袭和转移。方法通过转染沉默HepG2细胞(购自武汉普诺赛生命技术公司)FBW7的表达48 h后,实验组为沉默FBW7的HepG2细胞,对照组为空白载体转染,分别检测FBW7、Snail mRNA及蛋白表达。通过划痕实验和Transwell方法检测下调FBW7对HepG2细胞侵袭和转移的影响。组间比较采用t检验。结果转染沉默HepG2细胞FBW7基因表达后,FBW7 mRNA(0.31±0.06比0.98±0.25,t=-7.813,P7,P7,t=18.630,P75±0.20比1.00±0.00,t=11.323,P71.00±55.32)个比(162.00±33.14)个,t=4.138,PFBW7可能通过泛素化修饰Snail而抑制肝癌细胞HepG2的侵袭转移。

关键词： FBW7 Snail 肝细胞癌侵袭转移

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泛素连接酶FBW7介导LDHA/Lactate/miR-223正反馈回路调控糖酵解在弥漫大B细胞淋巴瘤进展中的机制

泛素连接酶Fbw7介导LDHA/Lactate/miR-223正反馈回路调控糖酵解在...

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作者：郭泰然汕头大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治... 详细信息

研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治疗的异质性,所以深入研究难治性DLBCL的分子机制极其重要。弥漫大B细胞淋巴瘤预后与LDH生化指标密切相关,而在弥漫大B细胞淋巴瘤中鲜有报道代谢方面的具体机制及应用。FBW7(F-box and WD repeat domain containing 7)基因属于F-box蛋白家族,定位于人4号染色体(4q31.3),该家族还包括含WD-40结构域的F-box,包含富亮氨酸重复序列的F-box和包含不同蛋白质-蛋白质相互作用模块或无可识别基序的F-box。新近的研究显示FBW7在多种癌症中起不同的作用,提示其可能在不同癌症的发生发展中承担重要作用。在DLBCL中,我们的前期研究已证实泛素连接酶FBW7调控细胞凋亡在弥漫大B细胞淋巴瘤中发挥重要作用,但是其在代谢方面是否也起到作用目前仍不清楚。本研究旨在通过分子病理学及分子生物学方法,结合体内外功能研究,阐明FBW7在弥漫大B细胞淋巴瘤中的代谢作用及其相关分子机制,为深入理解弥漫大B细胞淋巴瘤发病机理提供新的理论思路。研究方法:1.用蛋白印迹检测,瞬时转染FBW7的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞后LDHA、HK2、LUT-1、PDK1等代谢分子蛋白的变化和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)验证FBW7与LDHA的相互作用,通过泛素化、蛋白降解实验评估FBW7对LDHA的调控作用,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估过表达FBW7对代谢功能的作用。2.调整SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞外乳酸浓度,用蛋白印迹实验检测后FBW7、LDHA和p Y10-LDHA的变化,用Micro RNA荧光定量PCR法检测miR-223含量变化。3.用蛋白印迹检测,瞬时转染miR-223的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞干扰FBW7后,LDHA和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估干扰FBW7对代谢功能的作用。4.用细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测方法检测,干扰LDHA的U2932、SUDHL-2肿瘤细胞后,弥漫大B细胞淋巴瘤代谢功能。5.用NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠,注入一定量的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞,分别使用miR-223模拟物、miR-223抑制剂及LDHA干扰片段,评估肿瘤增长情况。6.提取R-CHOP治疗后复发及非复发的DLBCL肿瘤样品组织的RNA,通过Micro RNA荧光定量PCR法测定miR-223含量。研究结果:1.过表达FBW7可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力,机制研究发现,FBW7能够通过调控LDHA的泛素化降解,使LDHA、磷酸化的p Y10-LDHA明显下调。2.糖酵解最终产物乳酸抑制FBW7表达,促进LDHA、p Y10-LDHA的表达,并诱导miR-223的表达。3.瞬时转染miR-223可明显抑制FBW7表达,同时抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。4.干扰LDHA可明显抑制抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。5.体外实验miR-223激动剂能够促进弥漫大B细胞淋巴瘤皮下成瘤,而miR-223抑制剂及LDHA干扰片段抑制DLBCL细胞皮下成瘤。6.miR-223在治疗后复发DLBCL肿瘤样品中表达水平显著高于治疗缓解患者。研究结论:在弥漫淋巴大B细胞淋巴瘤中,FBW7可通过调控LDHA的泛素化从而抑制有氧糖酵解通路的激活,并受LDHA催化产物乳酸调控,而乳酸则具体通过miR-223调控FBW7,在肿瘤中代谢环境形成正反馈机制。

关键词： FBW7 乳酸弥漫大B细胞淋巴瘤 miR-223

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FBW7抑制肿瘤生长的机制及其研究进展

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泌尿外科杂志（电子版） 2022年第2期14卷 39-44页

作者：王新安徐成党吴登龙同济大学附属同济医院泌尿外科上海200065

肿瘤抑制基因FBW7突变体在多种肿瘤中高表达。FBW7通过靶向降解多种原癌蛋白如Brg1、Cyclin E、C-myc、Notch、c-Jun、Mcl-1和SREBP等调控细胞增殖、凋亡及能量代谢等多种生物学过程中的关键分子而发挥肿瘤抑制作用。本文将从FBW7靶向... 详细信息

肿瘤抑制基因FBW7突变体在多种肿瘤中高表达。FBW7通过靶向降解多种原癌蛋白如Brg1、Cyclin E、C-myc、Notch、c-Jun、Mcl-1和SREBP等调控细胞增殖、凋亡及能量代谢等多种生物学过程中的关键分子而发挥肿瘤抑制作用。本文将从FBW7靶向降解底物抑制肿瘤生长和FBW7突变、FBW7靶向降解底物突变和的FBW7自身紊乱三方面探究FBW7抑癌作用的消失进行综述。

关键词： FBW7 泛素化肿瘤抑制基因

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MiroRNA-223靶向抑制FBW7促进肝细胞癌对索拉非尼耐药的研究

MiroRNA-223靶向抑制FBW7促进肝细胞癌对索拉非尼耐药的研究

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作者：杨伟刚浙江大学

学位级别：硕士

背景:肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）发病率高,预后差,早期确诊手术根治是最佳治疗手段。然而临床确诊HCC患者多数处于中晚期,手术切除率低,缺乏有效的治疗手段。临床试验证明,针对肿瘤细胞发生机制中标志性的靶点进行有效干... 详细信息

背景:肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）发病率高,预后差,早期确诊手术根治是最佳治疗手段。然而临床确诊HCC患者多数处于中晚期,手术切除率低,缺乏有效的治疗手段。临床试验证明,针对肿瘤细胞发生机制中标志性的靶点进行有效干预的分子靶向药物索拉非尼能显著改善晚期HCC患者的病情。然而只有部分患者受益,部分患者出现耐药现象,即使联合用药疗效亦不满意。最近关于microRNAs（MiRNAs）分子机制方面的研究提示,miRNAs可能调节的各种信号通路的调节[22],miRNAs的失调,对索拉非尼耐药反应中起着不同的作用,它可能是导致索拉非尼耐药的原因。本研究旨在揭示miR-223与mRNA靶标F-box和含WD重复结构域7（FBW7）的调节关系,以及两者参与调节HCC对索拉非尼的耐药的作用关系。目的:研究microRNA-223在肝癌细胞系的表达情况,并研究其通过靶向调控fbw 7与肝细胞癌对索拉非尼的耐药的关系和机制。方法:研究观察miR-223表达与不同HCC细胞系对索拉非尼治疗的敏感性之间的关系。在索拉非尼不同敏感性的HCC细胞系中,使用RT-PCR测定miR-223表达。将miR-223 inhibitor,miR-22 3mimic 和含有 FBW7 siRNA 转染到 HCC 细胞中以调节miR-223和FBW7的表达水平。使用EdU和CCK-8检测评估细胞增殖。使用WB观察FBW7蛋白质表达水平。TargetScan网络服务器预测FBW7是miR-223的靶标,通过WB证实。结果:1、HCC细胞对索拉非尼的活力从高到低依次是Huh7,SNU449和SNU387;IC50依次为 8.749±0.876μM,13.4±1.05μM 和 15.72±1.58μM,miR-223 的表达水平与索拉非尼IC50表现呈相同的趋势。2、增加miR-223的表达能促进HCC细胞的活力。抑制miR-223的表达能显著增加索拉非尼对HCC细胞的治疗效果,敏感性增加。3、TargetScan预测FBW7就是miR-223的潜在靶标。分别增加或减少miR-223的表达,发现随着miR-223表达的变化HCC细胞中的FBW7表达有相应的变化。miR-223的过表达能显著抑制FBW7,同时在降低miR-223表达的HCC细胞中观察到相反的作用。4、索拉非尼治疗后,抑制FBW7表达能使HCC细胞活力增加同时具有更高的EdU阳性率。5.用FBW7 siRNA和FBW7 siRNA+miR-223抑制剂转染的HCC后,细胞活力没有差异。WB证实FBW7 siRNA可以消除miR-223抑制剂对增加FBW7表达的作用。结论:在具有索拉非尼耐药的HCC细胞中,miR-223的表达明显上调。降低miR-223的表达,可以调节增加靶基因FBW7的表达,从而显着增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性,提示miR-223可能是克服索拉非尼耐药的新治疗靶标。

关键词：肝细胞癌索拉非尼耐药性 miR-223 FBW7

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下调miR-27a表达对三阴乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2020年第2期40卷 188-193页

作者：程龙徐五琴张鹏黄建军李小宁皖南医学院弋矶山医院检验科芜湖241001 皖南医学院弋矶山医院病理科芜湖241001

目的·探讨下调mi R-27a表达对三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞系MDA-MB-453增殖、迁移和侵袭的影响。方法·采用实时荧光定量PCR方法检测68例TNBC患者癌组织及癌旁组织标本的miR-27a表达,分析miR-27a表达与患者临... 详细信息

目的·探讨下调mi R-27a表达对三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞系MDA-MB-453增殖、迁移和侵袭的影响。方法·采用实时荧光定量PCR方法检测68例TNBC患者癌组织及癌旁组织标本的miR-27a表达,分析miR-27a表达与患者临床特征的关系;并检测TNBC细胞系MDA-MB-453及正常乳腺上皮细胞MCF-10A中miR-27a表达的差异。在MDA-MB-453细胞中转染miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor),采用CCK-8实验、Transwell小室法检测miR-27a inhibitor转染组(mi R-27a inhibitor组)与mi R-27a阴性对照片段转染组(NC组)TNBC细胞增殖、迁移和侵袭能力的差异。蛋白质印迹法检测转染mi R-27a抑制物对MDA-MB-453细胞泛素连接酶FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)及Egl 9同源物2(Egl nine homolog 2,EGLN2)蛋白表达的影响。结果·TNBC组织中mi R-27a表达明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P7a表达与患者组织学分级、临床分期、淋巴结转移以及肿瘤最大直径相关(均P7指数无明显相关性。与MCF-10A细胞相比,MDA-MB-453细胞系中mi R-27a表达明显增高,差异有统计学意义(P7a抑制物后,MDA-MB-453细胞增殖与NC组相比明显减弱(P7a inhibitor组穿膜细胞均少于NC组(均P7a表达后mi R-27a inhibitor组较NC组FBW7蛋白表达显著升高,而EGLN2蛋白表达明显下降(均P7a在TNBC组织及细胞株中表达升高;下调mi R-27a表达可以抑制TNBC细胞MDA-MB-453的增殖、迁移和侵袭能力,这可能与其下调后FBW7蛋白表达增加、EGLN2蛋白表达减少有关。

关键词： miR-27a 三阴乳腺癌 FBW7 Egl 9同源物2 增殖迁移侵袭

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晚期非小细胞肺癌FBW7缺陷在多西紫杉醇耐药中的作用及机制探索

晚期非小细胞肺癌FBW7缺陷在多西紫杉醇耐药中的作用及机制探索

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作者：梁洪陆济南大学

学位级别：硕士

研究背景肺癌是危害全人类最常见的恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率位居所有恶性肿瘤的首位,并且在我国肺癌的发病人数正在迅速增加。在肺癌中,肺癌总数的80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中65%-80%NSCLC... 详细信息

研究背景肺癌是危害全人类最常见的恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率位居所有恶性肿瘤的首位,并且在我国肺癌的发病人数正在迅速增加。在肺癌中,肺癌总数的80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中65%-80%NSCLC患者在确诊时已属于晚期,手术切除率较低,综合治疗成为晚期肺癌的首要治疗方案,而化疗就是这综合治疗的重要组成部分。因为肿瘤耐药性的存在,导致许多患者肿瘤化疗后很快复发或进展,肿瘤的耐药性使很多重要的化疗药物得不到理想的疗效。寻找能预测药物治疗效果的生物标志物及逆转肿瘤对化疗药物的耐药性已成为NSCLC研究的焦点。多西紫杉醇是作用于细胞微管蛋白的抗微管类化疗药物,它的作用机理在于能阻止细胞内微管正常的生理聚集,使肿瘤细胞阻滞在G2/M期,从而引起细胞的凋亡。与其他化疗药一样,多西紫杉醇的耐药性降低了它的疗效。然而临床工作中尚无用于判断NSCLC患者多西紫杉醇治疗耐药的可靠指标。因此进一步研究它的耐药机制,发现新的耐药指标评估肿瘤耐药性,对肺癌个体化治疗,提高化疗疗效,具有很好的临床价值。目的研究FBW7在NSCLC对多西紫杉醇耐药中的作用。探讨FBW7诱导NSCLC耐药的机制,为逆转化疗药的耐药和发明新的化疗药物提供理论基础。方法利用RT-PCR及Western-blot检测目的基因FBW7在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药细胞株SPC-A1/DTX及亲本SPC-A1两种细胞中的表达差异;构建FBW7的过表达序列和干扰序列再经慢病毒包装分别转染SPC-A1/DTX及亲本SPC-A1细胞,通过单克隆筛选方法分别筛选出SPC-A1/DTX FBW7 O/E细胞株和SPC-A1 FBW7 D/R细胞株,再利用RT-PCR及Western-blot检测FBW7基因在SPC-A1/DTX及SPC-A1/DTX FBW7 O/E、SPC-A1及SPC-A1 FBW7 D/R细胞株间的表达差异。最后通过MTT比色法及克隆形成实验比较上调FBW7及下调FBW7的表达后细胞对化疗药物多西紫杉醇敏感性的影响。结果经过RT-PCR及Western-blot证明,FBW7在NSCLC多西紫杉醇耐药细胞株SPC-A1/DTX中的表达显著低于亲本细胞株SPC-A1。通过慢病毒转染及单克隆筛选,构建了FBW7表达下调的SPC-A1 FBW7 D/R细胞株和上调的SPC-A1/DTX FBW7 O/E细胞株。再利用RT-PCR及Western-blot检测到FBW7在SPC-A1细胞株、SPC-A1/DTX FBW7 O/E细胞株中的表达高于SPC-A1/DTX FBW7 O/E细胞株和SPC-A1/DTX细胞株。最后通过MTT比色法及克隆形成实验表明SPC-A1细胞株、SPC-A1/DTX FBW7 O/E细胞株对多西紫杉醇的敏感性高于SPC-A1 FBW7 D/R细胞株和SPC-A1/DTX细胞株。结论非小细胞肺癌对多西紫杉醇的敏感性在FBW7高表达的细胞中要高于FBW7低表达的细胞;FBW7基因的缺失与NSCLC对多西紫杉醇的耐药性有关。但FBW7缺失引起非小细胞肺癌对多西紫杉醇发生耐药的具体机制还需要深入研究。

关键词：非小细胞肺癌多西紫杉醇 FBW7

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FBW7泛素化修饰Snail抑制NSCLC转移的实验研究

FBW7泛素化修饰Snail抑制NSCLC转移的实验研究

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作者：张勇中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

作为泛素连接酶SCF复合体中的一种F-box分子,FBW7（F-box/WD repeat-containing protein 7）在调控细胞周期、细胞增殖、分化、凋亡和转移等细胞生物学过程中起到重要作用。FBW7在人体组织内广泛存在。FBW7作为重要的抑癌蛋白参与多种... 详细信息

作为泛素连接酶SCF复合体中的一种F-box分子,FBW7（F-box/WD repeat-containing protein 7）在调控细胞周期、细胞增殖、分化、凋亡和转移等细胞生物学过程中起到重要作用。FBW7在人体组织内广泛存在。FBW7作为重要的抑癌蛋白参与多种细胞生理和病理活动。FBW7表达含量的降低可促使某些癌蛋白不能被降解继而引起细胞和组织正常功能的变化,诱导癌症的发生。这一现象在许多不同类型肿瘤中广泛存在。此外,FBW7表达降低可促使某些肿瘤发生远处转移。由此可见,作为抑制癌症发生发展的新兴靶点,在一定范围内提高体内FBW7表达水平可能在延缓癌症进展和避免肿瘤晚期转移等方面发挥关键作用。本实验从肿瘤侵袭转移角度入手,以NSCLC为研究对象,探讨FBW7在参与转录抑制因子Snail蛋白的泛素化修饰和降解过程并抑制上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和肿瘤转移的机制研究。第一部分:目的:明确NSCLC组织中FBW7的表达水平,探索FBW7在正常肺组织和NSCLC中的表达差异,从组织水平研究FBW7与NSCLC在转移作用中的相关性并从EMT角度阐释FBW7在肺癌中引起转移的作用。方法:通过临床数据库分析FBW7在NSCLC中的表达差异和突变类型,将组织芯片进行免疫组织化学染色明确FBW7的表达情况,在NSCLC样本中通过Western blot方法检测FBW7和E-cadherin的表达水平并进行统计学分析。结果:FBW7基因在mRNA水平的变化主要集中于NSCLC中的腺癌,其变异程度呈多样性,但以点突变为主;FBW7高表达患者总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression free survival,PFS）均较FBW7低表达患者明显延长;患者肿瘤组织标本中的FBW7表达水平较其正常肺组织明显降低;肿瘤组织内FBW7表达水平明显高于肿瘤组织,作为上皮间质转化的标志物之一的E-cadherin的变化与FBW7表达一致且两者间存在相关性。结论:FBW7可作为抑癌基因在细胞组织内发挥作用,其表达增高提示良好的远期预后,患者的OS及OFS较FBW7低表达患者显著延长;肿瘤组织中FBW7蛋白表达明显低于正常肺组织,且FBW7表达的变化可能是引起肿瘤侵袭转移能力变化的一个重要原因;可将FBW7表达水平作为评价NSCLC患者预后的临床参考指标。第二部分:目的:明确FBW7与Snail间的相关性;FBW7表达降低对细胞侵袭转移能力的影响;下调FBW7表达水平引起细胞侵袭转移能力的变化与Snail蛋白稳定性间的关系。方法:给予FBW7激动剂处理并导入相关质粒从内源性和外源性角度探索FBW7与Snail间的作用关系;获取转基因小鼠MEF细胞并通过下调表达明确FBW7与肿瘤转移之间的关系;构建低表达FBW7的稳定细胞系通过平板克隆形成实验观察细胞形态并经Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化;对小鼠进行尾静脉注射并经小动物成像检测不同FBW7表达水平的肺癌细胞转移能力和细胞成瘤性的影响。结果:在黑色素瘤细胞系中,上调FBW7表达后Snail表达水平降低且其半衰期较正常组明显缩短;提高FBW7表达后Snail蛋白含量明显降低,而给予MG132处理后Snail表达升高;导入Cre质粒后可敲除MEF细胞中FBW7的表达,内源性Snail表达明显升高,间质细胞标记物Vimentin表达上升;A549和H1299肺癌细胞系中Snail呈高表达状态,下调两株细胞FBW7水平可使细胞形态发生变化且侵袭转移能力发生改变;下调FBW7的Lewis肺癌细胞成瘤性和转移能力明显增强。结论:上调FBW7可通过蛋白酶体途径引起Snail蛋白稳定性下降;下调FBW7可引起Snail表达上升,导致EMT过程的发生,使上皮来源肿瘤细胞获得间质细胞特性,并可在体内引起肿瘤转移能力和成瘤性的升高。第三部分:目的:明确Snail氨基酸序列内PEST结构域的保守性;探索FBW7降解Snail的潜在分子机制;研究FBW7与Snail的结合方式和降解作用机制。方法:通过分析不同种属Snail氨基酸序列并分析PEST结构域的保守性;将不通过质粒导入细胞给予蛋白酶体抑制剂处理并通过Western blot方法检测相关分子表达水平;运用co-IP方法研究FBW7与Snail分子间的相互作用关系。结果:Snail蛋白的氨基酸序列中存在PEST结构域,且无种属特异性;随着FBW7表达升高,Snail表达水平下降;与FBW7 FL组相比,FBW7ΔF组Snail蛋白表达升高;内源性和外源性水平证实FBW7与Snail存在相互作用关系。结论:Snail可通过某种方式被磷酸化修饰进而被泛素化降解,且这种作用依赖于FBW7的表达水平和结构完整性,两者间可通过直接的相互作用结合实现Snai

关键词： FBW7 EMT Snail 肿瘤侵袭转移

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