早期阿尔茨海默病鼠模型（presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠）海马中甲基化致病基因的筛选研究

作     者：张元 

作者单位：四川医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐明希

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：presenilin 阿尔茨海默病 DNA甲基化 RRBS 

摘      要：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理特征主要表现为大脑特定区域神经元退行性病变,尤其在海马、大脑皮层等区域。其临床表现主要是从初期的学习记忆障碍,认知功能障碍,到晚期的痴呆症候群。虽然关于AD的发病机制存在诸多假说,如胆碱能神经元假说、Aβ毒性假说、Tau蛋白假说、胰岛素假说、自由基损伤假说、基因变异假说等,但是其具体致病机制尚未完全研究清楚。近年来,大量研究表明基因异常甲基化与AD紧密相关,如早发性家族性阿尔茨海默病(early-onset familial Alzheimer’s disease,FAD)中存在早老素(Presenilins)基因及淀粉样前体蛋白(APP)基因的甲基化异常,是其FAD早期发病的原因之一。presenilin-1/presenilin-2(PS1/PS2)基因可编码高度同源的跨膜蛋白γ-分泌酶,该酶参与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)合成后加工及转运,从而影响β淀粉样蛋白(amyloid peptide,Aβ)的形成,其变异可加速Aβ的产生和沉积,而Aβ的过量产生和积聚可导致神经元轴突的损伤及神经死亡,从而引起AD发生。在晚发散发性阿尔茨海默病(late-onset Alzheimer’s disease,LOAD)中也发现如TMEM59和SORL1基因启动子区域及Apoe基因存在异常甲基化改变的现象。为探讨是否还存在其它甲基化异常基因参与到AD,尤其是早期AD的发病机制中,本实验首先繁育及筛选出阿尔茨海默病小鼠模型,即条件性presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠(dKO mice),作为本研究的实验目的鼠,该小鼠7月龄时表现出类似于早期AD的部分神经退行性病变,如轻度皮质萎缩、神经元凋亡及tau-蛋白磷酸化以及轻度认知功能障碍等,符合早期AD动物模型的要求;然后再通过基因测序技术分析早期AD海马组织中DNA甲基化变化情况,以获取更多的与早期AD相关的甲基化异常基因。方法:选取野生型及PS1/PS2双基因敲除同系小鼠进行饲养并繁殖,再将子代杂合子小鼠进行交配,并通过提取子代小鼠鼠尾基因组DNA,采用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因类型。实验分别选取3只7月龄dKO mice及3只7月龄野生型小鼠,提取海马组织基因组DNA,运用简化的表观亚硫酸盐测序技术(Reduced Representation Bisulphite Sequencing,RRBS)检测基因组DNA异常甲基化分布及类型,利用相关生物软件对照分析以获得异常甲基化基因,并进行在线功能分析。结果:本实验成功饲养和繁殖PS1/PS2双基因敲除早期阿尔茨海默病模型小鼠。利用Bismark(vO.7.4)软件与野生小鼠参考基因组序列进行比对,运用DAVID在线分析网站进行功能基因的GO与KEGG功能分析及差异甲基化区域(DMR)分析,获得30个甲基化异常基因,在不同的染色体上分析获得异常甲基化位点1338个,涉及873个基因。结论:使用正确的饲养繁育以及鉴定方法是获得PS1/PS2双基因敲除小鼠的有效途径。本实验通过RRBS成功挑选出早期AD鼠模型甲基化异常基因,为今后建立早、中、晚各期AD的DNA甲基化图谱以及获得甲基化致病基因奠定基础,也为更深入地探索AD的发病机制,以及制定预防、早期诊断及治疗方案提供重要的参考依据。