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基于体液特异性单倍型甲基化标记鉴定体液斑的研究

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基于体液特异性单倍型甲基化标记鉴定体液斑的研究

作者：王含笑华中科技大学

学位级别：硕士

背景基于组织特异性DNA甲基化标记鉴定法医体液斑的组织来源是近年来法医学的研究热点。相较于个体差异性较大的组织特异性单CpG位点,区域性的甲基化单倍型则表现出更高的稳定性和体液特异性,有望成为更具法医学应用价值的体液鉴定标... 详细信息

背景基于组织特异性DNA甲基化标记鉴定法医体液斑的组织来源是近年来法医学的研究热点。相较于个体差异性较大的组织特异性单CpG位点,区域性的甲基化单倍型则表现出更高的稳定性和体液特异性,有望成为更具法医学应用价值的体液鉴定标记。基于大规模平行测序技术的靶向甲基化测序能够精准探知各样本靶片段上所有CpG位点的甲基化状态,有助于深入分析甲基化单倍型信息。前期研究对41个体液特异性甲基化CpG位点所在区域片段进行靶向测序,验证了包含多位点的甲基化单倍型标记确实有助于增强DNA甲基化的组织特异性,联合运用这些单倍型标记能有效提升鉴定体液斑的准确率。利用各类体液特异性甲基化标记已能实现对常规体液的准确推断,但偶尔月经血样本会与阴道液或血液相混淆。月经血细胞成分复杂,其混合组分的整体甲基化水平的个体差异性较大。当前研究报道的月经血特异性甲基化片段极少,仍不足以准确判别所有月经血样本,因此亟需寻找更多的特异性强的甲基化标记实现对月经血的准确甄别。目的基于靶向甲基化测序技术构建组织特异性甲基化复合检测体系,验证其对单一体液斑的鉴定效能,测试复合检测体系的灵敏度和其对陈旧样本的检测能力。结合随机森林模型探索其在法医学体液斑鉴定方面的应用价值。发掘新的月经血特异性甲基化标记以期更好地实现对月经血的鉴别。方法采集170份体液样本(包含血液、精液、唾液、阴道液、月经血),基于前期实验结果筛选出的25个体液特异性甲基化片段构建复合扩增体系,构建甲基化片段扩增子文库进行Miseq测序,获取并计算靶片段上全部CpG位点的甲基化水平,为每种体液筛选体液特异性强、稳定性好的单倍型标记。根据单倍型甲基化建立体液推断随机森林模型,测试其推断常规体液的准确性。设置不同的多重扩增DNA输入量、保存不同时间的陈旧样本,分别测试靶向甲基化测序检测甲基化准确推断体液的灵敏度和准确推断陈旧性样本的能力。利用rrbs测序筛选有差异的月经血甲基化位点,通过MPS靶向测序初步验证其对各类常见体液斑的鉴别能力。结果所有样本的各靶片段测序结果质量良好,且在靶体液与其他体液之间均呈现显著性差异,对低至0.2 ng的DNA输入量、放置6月余的陈旧样本也均有较稳定的鉴定结果。筛选特异性、稳定性更好的5个单倍型标记构建随机森林模型后,模型对常规体液样本及陈旧样本均达到了100%的预测准确率,对灵敏度测试的低DNA输入量样本亦达到良好预测率94.67%。比较分析rrbs甲基化差异性数据,筛选出10个月经血特异性甲基化CpG位点进行靶向扩增子甲基化多样本验证,结果证实其中同一片段上的2个位点在月经血与其它体液中具有显著性差异,有潜力成为月经血鉴定的特异性标记。将二者合并作为月经血特异性单倍型建立随机森林模型,模型对月经血的识别率达到了100%。结论本研究基于靶向甲基化扩增子测序建立的组织特异性甲基化片段检测方法,可准确检测各种体液特异性区域的甲基化模式,基于体液特异性甲基化单倍型标记构建的体液推断模型可实现对各种体液的准确推断,并具有较高的检测灵敏度,对陈旧体液样本的推断也具有较高的准确率。本研究新发现了有助于更好鉴别月经血的特异性甲基化标记用于体系的补充及优化。

关键词： DNA甲基化体液斑鉴定甲基化单倍型 MPS rrbs 随机森林模型

大气PM暴露诱导PDGFRβ基因高甲基化致心毒性的研究

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大气PM暴露诱导PDGFRβ基因高甲基化致心毒性的研究

作者：张莹青岛大学

学位级别：硕士

目的:越来越多的证据表明,大气颗粒物(Particulate Matters,PM)暴露可诱导心毒性,但相关致病机制尚不明确。本研究通过构建真实环境颗粒物暴露模型、心肌细胞血小板衍生生长因子受体β(Platelet Derived Growth Factor Receptorβ,PDGFR... 详细信息

目的:越来越多的证据表明,大气颗粒物(Particulate Matters,PM)暴露可诱导心毒性,但相关致病机制尚不明确。本研究通过构建真实环境颗粒物暴露模型、心肌细胞血小板衍生生长因子受体β(Platelet Derived Growth Factor Receptorβ,PDGFRβ)高表达模型、小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型、心肌细胞甲基化抑制模型深入探讨大气PM暴露诱导PDGFRβ基因高甲基化致心毒性的潜在机制,为寻找大气PM暴露致心毒性潜在生物标志物提供重要的实验依据和新的研究方向。方法:1.基于rrbs的大气PM暴露致小鼠心脏组织DNA甲基化差异基因的筛选。2018年11月至2019年1月在河北省石家庄市,通过真实环境颗粒物暴露模型,对雄性C57BL/6小鼠进行为期6周的PM染毒。实验随机分为对照组和PM暴露组。利用简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,rrbs)观察小鼠心毒性相关的DNA甲基化模式的变化;利用高通量的重亚硫酸盐测序法(Next Generation Sequencing-Bisulfite Sequencing PCR,NGS-BSP)验证PDGFRβ启动子甲基化水平;利用HE染色观察小鼠心脏组织病理改变;利用实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR,RT-qPCR)检测PDGFRβ基因mRNA的表达水平;利用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验检测PDGFRβ及其下游MEK/ERK通路相关蛋白的表达水平。2.大气PM诱导PDGFRβ基因高甲基化致心肌肥厚的作用机制研究。1)构建心肌细胞PDGFRβ高表达模型:在原代心肌细胞及AC16心肌细胞构建PDGFRβ高表达模型,实验分为4组:对照组、大气PM暴露组、PDGFRβ高表达组(h PDGFRβ)、PDGFRβ高表达后大气PM暴露组(h PDGFRβ+PM)。2)构建小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型:通过尾静脉注射腺相关病毒9(Adeno Associated Virus 9,AAV9)20天后,构建心脏组织PDGFRβ高表达模型;实验分为6组:空白对照组、大气PM暴露组、PDGFRβ高表达组(h PDGFRβ)、空病毒组(PDGFRβ-con)、空病毒注射后大气PM暴露组(PDGFRβ-con+PM)、PDGFRβ高表达后大气PM暴露组(h PDGFRβ+PM)。3)构建心肌细胞甲基化抑制模型:利用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5AZA)处理原代心肌细胞及AC16心肌细胞构建甲基化抑制模型,实验分为4组:对照组、大气PM暴露组、甲基化抑制剂组(5AZA)、甲基化抑制后大气PM暴露组(5AZA+PM)。4)利用CCK8实验检测心肌细胞的活力及绿色荧光检测心肌细胞病理改变;利用RT-qPCR及WB检测PDGFRβ及其下游MEK/ERK通路上相关基因mRNA及其蛋白的表达。利用RT-qPCR检测DNA甲基转移酶1(DNA Methyltransferase 1,DNMT1)、DNA甲基转移酶3A(DNA Methyltransferase 3A,DNMT3A)、DNA甲基转移酶3B(DNA Methyltransferase 3B,DNMT3B);心肌肥厚标志物相关基因心房利钠因子(Atrial Natriuretic Factors,ANF)、脑利钠因子(Brain Natriuretic Factor,BNF)、β肌球蛋白重链(β-Myosin Heavy Chain,β-MHC)mRNA的表达。利用超声心动图检测小鼠的心功能。3.大气PM暴露诱导DNA甲基化水平改变致心肌脂代谢紊乱的影响。通过上述构建的真实环境颗粒物暴露模型、心肌细胞PDGFRβ高表达模型、小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型,观察小鼠心脏及心肌细胞脂滴累积变化;脂质组学检测PM暴露与非暴露组小鼠心脏组织脂质代谢的变化;利用WB检测PDGFRβ下游MEK/ERK通路相关蛋白及过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisomal Proliferator Activated Receptorα,PPARα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomal Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)的表达。结果:1.基于rrbs的大气PM暴露致小鼠心脏组织DNA甲基化差异基因的筛选。1)rrbs结果:共检测到差异甲基化基因6604个,其中高甲基化基因占57.66%,低甲基化基因占42.34%。差异甲基化基因共富集在271条通路上,其中差异显著性较大且与心毒性密切相关的信号通路为MAPK中的MEK/ERK通路。MEK/ERK通路上发现一个重要的与心毒性相关的差异甲基化基因

关键词： rrbs PM 心毒性 PDGFRβ

rrbs数据分析新流程的建立及其在肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分析的应用

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RRBS数据分析新流程的建立及其在肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分...

作者：祝海军华东师范大学

学位级别：硕士

DNA甲基化是非常重要的表观遗传修饰之一,在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因组印记、肿瘤发生等方面扮演着重要的角色。DNA甲基化谱式异常是肿瘤的重要特征之一,目前在大部分肿瘤细胞中都发现了整体的DNA甲基化水平降低和部分区... 详细信息

DNA甲基化是非常重要的表观遗传修饰之一,在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因组印记、肿瘤发生等方面扮演着重要的角色。DNA甲基化谱式异常是肿瘤的重要特征之一,目前在大部分肿瘤细胞中都发现了整体的DNA甲基化水平降低和部分区域的甲基化水平增高,但具体的DNA甲基化异常的分子机制目前尚不清楚。简化的有代表性的重亚硫酸盐测序(rrbs)技术是近年来发明的全基因组水平的DNA甲基化分析技术,但是因为其数据分析的复杂性,现有的分析软件不能完全满足研究的需要。起始性DNA甲基转移酶DNMT3A在肿瘤细胞DNA甲基化谱式异常中的作用并不清楚,我们利用rrbs技术检测了在肺癌细胞A549中过表达DNMT3A之后基因组DNA甲基化的谱式变化。通过完善数据分析流程后,我们发现过表达DNMT3A之后,基因组DNA整体甲基化上升了9.1%,并且这种上升在不同基因特征区域间没有显著差异。另外,起始性的DNA甲基化变化比例并不高,更多的是已有甲基化水平的少量上升,而且重复序列的甲基化水平也呈现与整体相当的上升。进一步区域分析发现,过表达DNMT3A导致一些基因启动子区起始性的高甲基化,包括了RFPL3、 TFAP2E等,可能参与抑制肿瘤细胞的生长。以上结果显示DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化水平维持,并能调控一些肿瘤相关基因的启动子区甲基化水平。接下来,我们开发了单个分子连续CpG甲基化连锁分析方法,并加入了DNA甲基化与单核苷酸多态性连锁分析以及DNA甲基化与基因表达相关性分析。利用这些分析手段,我们发现肿瘤细胞系中普遍存在等位基因特异的DNA甲基化(ASM)。为了明确这些ASM的具体特征,我们在多种肿瘤细胞系中进行了rrbs检测和数据分析,同时比较了3个公开的人类胎盘rrbs数据,结果发现这些ASM除了已知的印记基因和X染色体失活相关的区域外,存在着大量的功能未知的基因组区域。但是,与胎盘中的结果不同,不同肿瘤细胞中的这些ASM没有共同性,提示其可能只是肿瘤DNA甲基化谱式紊乱的一种表现。为了进一步分析ASM产生和维持的分子机制,我们在肿瘤细胞系中改变维持性或起始性的DNA甲基化系统,包括过表达UHRF1、抑制表达UHRF1和过表达DNMT3A,并引入了DNMT3A基因与组蛋白互作结构域的突变体。通过rrbs检测结合数据分析流程,我们发现UHRF1对于ASM的维持是必须的,而新ASM的产生则需要DNMT3A介导,这种介导与DNMT3A结合组蛋白未修饰H3K4有关。当DNMT3A突变体结合甲基化的H3K4或者不结合H3K4时,产生的新ASM显著增多,推测是导致了起始性的DNA甲基化所致。最后,我们结合了肿瘤细胞RNAseq的基因表达数据,发现肿瘤细胞中的这些ASM与基因表达无明显的相关性。综合以上结果,肿瘤细胞中新发现的ASM与DNA甲基化维持和起始系统相关,但是不具有明确的调控基因表达功能,各种肿瘤细胞特异性极大,可能是肿瘤细胞DNA甲基化谱式紊乱的一种新的特征,是DNA甲基化化酶功能不足的一种表现,进一步的分子机制可以结合临床肿瘤样本开展。综上所述,本研究开发并完善了rrbs检测的数据分析流程,发现DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化谱式异常调控的证据;同时发现了肿瘤细胞系中大量新的ASM,并对他们的特征与功能进行了初步分析。本研究建立的分析流程可以应用到更多的DNA甲基化调控机制研究中去,本研究的结果可以为进一步阐明肿瘤细胞中DNA甲基化谱式紊乱的分子机制提供帮助。

关键词： rrbs 肿瘤 DNA甲基化 DNMT3A UHRF1 ASM

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不同猪种脂肪组织基因组DNA甲基化分析

基因组学与应用生物学 2018年第11期37卷 4730-4735页

作者：邓洛娜罗祖朋张志望李一星梁明振周磊亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西大学动物科学技术学院

本研究以典型的瘦肉型（杜洛克）和肥胖型（陆川）猪种为模型，利用新一代rrbs （Reduced Representation Bisulfite Sequencing）技术研究两猪种脂肪组织基因组启动子及CpG岛（CpG Islands，CGls）的DNA甲基化差异。我们分别取得杜洛... 详细信息

本研究以典型的瘦肉型（杜洛克）和肥胖型（陆川）猪种为模型，利用新一代rrbs （Reduced Representation Bisulfite Sequencing）技术研究两猪种脂肪组织基因组启动子及CpG岛（CpG Islands，CGls）的DNA甲基化差异。我们分别取得杜洛克、陆川样本中的Clean Reads 98720992、97254298，占各样品Reads的99．4％和99．56％;得到两样品中甲基化C位点（mC）中CG类型的甲基化所占比例最大；得到不同分布类型的mC差异；结果成功鉴定出两猪种脂肪组织基因组中的差异甲基化区域（Differentially methylated regions, DMRs），发现瘦肉型猪种（杜洛克）甲基化水平更高；共筛选出792个差异甲基化基因（Differentially methylated gene,DMG），对其进行GO、KEGG富集分析，得到其主要影响intracellular part、binding和biological regulation等生物学过程，参与了endocytosis、MAPK signaling pathway和calcium signaling pathway等与脂肪代谢相关的通路。本研究探索了脂肪代谢的表观遗传调控机制，为优质、高效的猪肉生产提供参考数据。

关键词：陆川猪 DNA甲基化 rrbs 信号通路

皮肤鳞状细胞癌相关异常甲基化基因的筛查及初步验证

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皮肤鳞状细胞癌相关异常甲基化基因的筛查及初步验证

作者：张瑞华北京协和医学院

学位级别：硕士

背景皮肤鳞状细胞癌是一种起源于表皮及其附属器角质形成细胞的恶性肿瘤。皮肤鳞状细胞癌发病率在皮肤恶性肿瘤中仅次于皮肤基底细胞癌,占第二位,该病的发病率较高,且处于不断上升之中。由于皮肤鳞状细胞癌的发病率日益增高,有较高的局... 详细信息

背景皮肤鳞状细胞癌是一种起源于表皮及其附属器角质形成细胞的恶性肿瘤。皮肤鳞状细胞癌发病率在皮肤恶性肿瘤中仅次于皮肤基底细胞癌,占第二位,该病的发病率较高,且处于不断上升之中。由于皮肤鳞状细胞癌的发病率日益增高,有较高的局部及远处转移率,因此对其发病机理的研究日渐引起人们的重视。表观遗传学即在不改变基因组序列的前提下,通过DNA甲基化和组蛋白修饰来调控基因表达。DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。目的筛选出候选基因,并初步验证其在皮肤鳞状细胞癌发病中的表观遗传学作用。方法采用rrbs方法检测皮肤鳞状细胞癌及癌旁组织基因组甲基化水平,采用RNA-Seq方法检测皮肤鳞状细胞癌及癌旁组织基因转录组,筛选出皮肤鳞状细胞癌异常甲基化基因,扩大样本量,采用QPCR方法进行目的基因mRNA水平的检测。结果通过rrbs和RNA-seq技术,本研究共获得了 ACACB等23个候选基因。扩大样本验证,结果显示,皮肤鳞状细胞癌中这些目的基因mRNA水平降低。结论目的基因启动子区域的异常甲基化可能参与了皮肤鳞状细胞癌的发病过程,需要进一步研究其在该病中的表观遗传功能。

关键词：皮肤鳞状细胞癌 rrbs RNA-seq 目的基因甲基化

0.18μm CMOS 12位300MS/s分段电流舵DAC的研究与设计

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0.18μm CMOS 12位300MS/s分段电流舵DAC的研究与设计

作者：董舒路南京邮电大学

学位级别：硕士

数模转换器（DAC）在雷达、电子战争、有线或无线通信等很多领域都发挥着极其重要的作用。在通信领域中,它作为发射机系统的关键一环更是严重制约着整个系统性能的提升。为了紧跟数字信号处理系统的发展脚步,高速高精度DAC的研究与设计... 详细信息

数模转换器（DAC）在雷达、电子战争、有线或无线通信等很多领域都发挥着极其重要的作用。在通信领域中,它作为发射机系统的关键一环更是严重制约着整个系统性能的提升。为了紧跟数字信号处理系统的发展脚步,高速高精度DAC的研究与设计俨然成为了一个重要的发展潮流。众所周知,二进制码DAC结构简单、速度较快,但线性度较差,而温度计码DAC线性度较好,但结构复杂、转换速度慢。为了同时满足高速和高精度的要求,通常采用分段式电流舵DAC结构,以兼顾两种译码电路的优点。在此基础上,本文提出了分段模式为“8 MSBs+4 LSBs”、采样率为300MS/s的12位电流舵DAC。对于传统的分段式电流舵DAC,低有效位数常常通过二进制码DAC来实现,而高有效位数则采用温度计码DAC。首先,因为二进制码DAC在中码转换时所有开关均参与变化,导致DAC输出的毛刺很大,影响系统的非线性,所以本文DAC的4 LSBs部分采用分裂码DAC进行替代。分裂码DAC不仅能够弥补二进制码DAC上面提到的缺点,相较于温度计码DAC,还拥有简单的译码电路。其次,为了进一步改善系统的动态性能,还对分裂码译码电路的输出使用基于随机旋转的二进制加权选择（rrbs）技术,从而在不改变每一个分裂码所对应的电流源权重的基础上,将开关活动进行随机化,增加了低有效位数电流源的匹配性。再者,由于传统的二进制码-温度计码译码电路的结构复杂、传输延时高,因而对其真值表进行全新解读,即以二进制输入码为参考由高位向低位进行二分操作,并设计出一个新的向温度计码转换的译码电路。最终,通过锁存电路对不同的译码电路进行时序上的同步,以避免DAC的输出出现误码的现象。同时,开关采用差分对的形式以抑制偶数阶谐波,而电流源则采用PMOS cascode结构以增加输出阻抗。为了设计的电流源接近理想状态,还专门为电流源阵列设计一个宽摆幅、高输出阻抗的偏置电路,包括带隙基准电路、电压转电流电路和电流源偏置电路。最后,采用0.18μm CMOS工艺对系统的静态性能和动态性能进行后仿真验证。结果表明,本文DAC的DNL和INL分别是±0.08LSB和-0.1～1LSB。当正弦波输入信号的频率为1.098633MHz 时,该 DAC 的 SFDR、ENOB、SNDR 以及 THD 分别为 81.44dB、11.22bit、69.33dB和-80.68dB。当输入信号频率等于149.9268MHz时,SFDR、ENOB、SNDR以及THD分别为64.97dB,10.38bit,64.27dB和-64.89dB。在单端负载电阻为50Ω、电源电压为1.8V的情况下,平均功耗为51.43mW。

关键词：高速高精度分段式DAC 电流舵DAC rrbs 无杂散动态范围

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不同猪种脂肪组织基因组DNA甲基化分析

不同猪种脂肪组织基因组DNA甲基化分析

作者：邓洛娜广西大学

学位级别：硕士

甜菜碱具有甲基供体的作用,影响甲基化修饰,促进脂肪代谢。在生产实践中,猪在饲喂甜菜碱之后,其肌内脂肪含量显著增加,提示DNA甲基化是调控脂肪代谢的重要因素。因此,开展甲基化的研究对畜禽生产、养殖有着重要意义。我们在比较胴体性... 详细信息

甜菜碱具有甲基供体的作用,影响甲基化修饰,促进脂肪代谢。在生产实践中,猪在饲喂甜菜碱之后,其肌内脂肪含量显著增加,提示DNA甲基化是调控脂肪代谢的重要因素。因此,开展甲基化的研究对畜禽生产、养殖有着重要意义。我们在比较胴体性状和肉质差异的基础上,以杜洛克、陆川两猪种为典型的瘦肉型和脂肪型动物模型进行实验。利用新一代简化的重亚硫酸盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,rrbs)研究这两猪种脂肪组织基因组中启动子(promoter)及CpG岛(CGIs)区域的DNA甲基化水平及功能。分别取得杜洛克、陆川样本中Clean Reads为98720992、97254298,占各样品Reads的99.4%和99.56%。我们通过甲基化分析,得到两样品中甲基化C位点(mC)中CG类型的甲基化所占比例最大;得到样品内不同区域和样品间相同区域中不同分布类型的mC都有所差异;分别从两样品中各选取了 10、17、18号染色体展示了其启动子、CGI和两个区域的overlap甲基化图谱,图示同一样品不同号染色体和不同样品同一号染色体的甲基化分布差异;通过差异与富集分析,成功鉴定出两猪种脂肪组织基因组中的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs),并且将其注释到基因本体上发现其主要分布在基因的内含子区;绘制DMRs中不同样品的甲基化水平,结果发现瘦肉型猪种(杜洛克)甲基化水平更高;共筛选出792个差异甲基化基因(Differentially methylated gene,DMG),对其进行GO、KEGG富集分析,得到其主要影响intracellular part、binding和 biological regulation 等生物学过程,参与了 endocytosis、MAPK signaling pathway和calcium signaling pathway等与脂肪代谢相关的通路。与转录组测序结果进行联合分析,通过对差异表达基因的甲基化水平分析,得到差异表达基因的启动子区杜洛克的甲基化程度更高;通过分析甲基化修饰与表达调控的关系,得到杜洛克在启动子区甲基化基因表达量更低;分析甲基化水平与功能元件长度关系,得到两样品中不同分布类型DNA甲基化水平随着功能原件长度变化的趋势存在差异。与全基因组重测序结果进行联合分析,通过对两样品中既是突变位点,又是差异甲基化位点的甲基化分析,结果表明在突变位点杜洛克的甲基化程度高于陆川,得到单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)对杜洛克甲基化的影响更高,这也为DMRs中杜洛克DNA甲基化更高的结果提供了数据支持。本研究对DNA甲基化规律、DNA甲基化水平与基因表达调控的关系,影响DNA甲基化水平的因素进行了探究。将DNA的表观遗传与脂肪代谢联系起来,为优质、高效的猪肉生产提供了理论依据,对畜禽养殖业发展有重要意义。

关键词：陆川猪 DNA甲基化 rrbs 信号通路差异表达基因 SNP

高通量分析人食管鳞癌甲基化差异基因的相关研究

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高通量分析人食管鳞癌甲基化差异基因的相关研究

作者：沈笑北京协和医学院

学位级别：硕士

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球肿瘤发病率的第八位,死亡率占癌症相关死亡率的第六位。我国食管癌发病率占世界首位,是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)高发地区,约占全球范围内的70%。... 详细信息

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球肿瘤发病率的第八位,死亡率占癌症相关死亡率的第六位。我国食管癌发病率占世界首位,是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)高发地区,约占全球范围内的70%。近年来,其发病率虽有所下降,但ESCC的长期预后仍然较差,术后五年生存率只有15%～25%。DNA甲基化异常改变被认为是ESCC发生发展的常见分子机制之一,主要特征是全基因组低甲基化和位点特异CpG岛高甲基化。进一步了解DNA异常甲基化如何调控ESCC的发生与发展,寻找ESCC甲基化异常改变分子标志物,在指导人们对ESCC患者预后判断以及制定有效治疗方案等方面具有重要临床意义。在本文的第一部分研究中,我们用简化的、具有代表性的DNA甲基化测序(rrbs)及基因表达谱芯片高通量分析技术分析了7例ESCC患者癌及其癌旁组织DNA甲基化水平和mRNA表达水平。先对ESCC和其癌旁差异甲基化基因进行功能富集分析,差异基因主要功能富集在分子连接与调节、细胞组成与调节、催化活性与代谢调节等。另外,细胞运动、物质运输以及细胞间相互作用相关基因发生较大改变。接着,结合前期表达谱芯片结果,筛出位于启动子区DNA甲基化与基因表达水平呈负相关基因。为了筛选ESCC发生发展过程中特异的甲基化改变基因,挑选前10个具有显著差异的基因,结合功能和文献检索,筛选出甲基化升高同时表达降低基因Cyclin Y-like l(CCNYL1)进行后续研究,经过癌症基因组图谱数据库(TCGA)预测获得其在ESCC中未有突变、缺失和扩增等改变。进一步我们用硫化测序PCR(BSP)技术在17对ESCC组织中验证DNA甲基化水平和Real-time PCR技术在10对冰冻ESCC组织中验证mRNA表达水平,结果与rrbs和表达谱芯片结果一致,CCNYL1在ESCC组织中呈高甲基化低表达。经统计学分析,在ESCC中CCNYL1基因DMR处CpG位点13、CpG位点16、CpG位点17、CpG位点18和CpG位点19呈现高甲基化。与人食管上皮永生化细胞株相比,CCNYL1在ESCC细胞株中DNA甲基化水平显著升高,mRNA表达水平降低。然后,通过体外实验在ESCC细胞株中过表达CCNYL1基因,结果显示其对癌细胞增殖有抑制作用。最后,我们采用表观遗传治疗法,经5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dC)处理ESCC细胞株后,CCNYL1基因启动子区DNA甲基化水平降低,而mRNA表达升高,说明甲基化直接调节CCNYL1的表达。另外DMR中CpG位点13、16、17和19甲基化水平显著降低,为肿瘤治疗提供分子基础。所以,CCNYL1基因高甲基化可能参与ESCC的发生,其DMR可能为肿瘤治疗提供新靶点。在本文第二部分的研究中,筛选前期高通量分析获得ESCC淋巴结转移和无淋巴结转移组中甲基化程度与表达水平负相关基因,DMR位于启动子区的差异基因共5个,其中ODC1已在食管癌中有报道,PHB2、 PCMT1、 ARHGEF4在癌症中也有许多研究,只有HSD11B1L研究较少,本部分重点研究HSD11B1L在ESCC发生发展中作用。经验证HSD11B1L在ESCC组织及细胞株中DNA甲基化水平下降(P<0.001),与mRNA表达成负相关,并且在淋巴结转移的ESCC组织中,其甲基化水平低于无淋巴结转移的组织(P<0.001)。另外,在ESCC细胞株中,敲降HSD11B1L影响其恶性程度,能抑制细胞的增殖和侵袭能力。为探索HSD11B1L甲基化频率与临床病理参数之间的相关性,另外增加20例淋巴结转移和20例无淋巴结转移的石蜡包埋ESCC组织用BSP检测HSD11B1L甲基化水平,结果表明,HSD11B1L在淋巴结转移的组织中甲基化水平低(P<0.001),提示HSD11B1L甲基化水平低的患者更容易发生转移。在癌组织中HSD11B1L的甲基化水平与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关联性(P=0.039,P=0.004)。将ESCC组织进行Kaplan-Meier生存分析,得到的结果是HSD11B1L异常低甲基化的ESCC病人预后较差(P=0.003),多变量Cox回归生存模型分析结果显示HSD11B1L的甲基化是ESCC病人的一个独立的预后因素(P=0.01)。所以,HSD11B1L异常低甲基化在ESCC发生发展中发挥重要作用,是一个独立的预后因素。

关键词： rrbs 食管鳞癌 CCNYL1 甲基化去甲基化 HSD11B1L 预后

Klinefelter综合征表达谱与DNA甲基化改变

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Klinefelter综合征表达谱与DNA甲基化改变

作者：赵玉霞天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过对克氏综合征(Klinefelter syndrome,KS)患者和正常人(男女)全基因组mRNA表达水平及DNA甲基化水平检测,寻找多余X染色体基因表达和甲基化改变与常染色体、Y染色体基因表达和甲基化的关系,进而探讨KS患者基因表达及甲基... 详细信息

目的:本研究通过对克氏综合征(Klinefelter syndrome,KS)患者和正常人(男女)全基因组mRNA表达水平及DNA甲基化水平检测,寻找多余X染色体基因表达和甲基化改变与常染色体、Y染色体基因表达和甲基化的关系,进而探讨KS患者基因表达及甲基化改变与其临床表型多样化之间的内在联系。方法:选取7例外周血淋巴细胞培养后G显带核型分析确定为47,XXY的KS患者作为实验组,同时分别选取7例身体健康无任何疾病史且正常生育的核型确定为46,XX女性和46,XY男性作为对照组。分别提取实验组和对照组成员外周血RNA和DNA,利用第二代高通量测序技术RNA-Seq对RNA进行表达谱分析,采用约化表示重亚硫酸盐测序方法(rrbs)对DNA进行全基因组甲基化水平检测。结果:1.根据FDR≤0.001和|log2Ratio≥1|标准,RNA表达谱结果显示:(1)KS(47,XXY)患者与正常男性对照组(46,XY)比较发现显著差异表达基因共216个,上调基因数100个,其中含X染色体基因4个,上调最显著的基因是XIST,此基因的主要功能是启动X染色体失活;常染色体基因96个。下调基因数116个,含X染色体基因5个;常染色体111个,下调最显著的基因是NR4A3,它主要和2型糖尿病有关;Y染色体不存在显著差异表达基因。(2)KS患者(47,XXY)与正常女性对照组(46,XX)比较发现上调基因118个,含X染色体基因3个,XIST基因没有明显差异表达;含Y染色体基因11个;常染色体104个。下调基因125个,含X染色体基因3个;常染色体122个。(3)男性对照组(46,XY)和女性对照组(46,XX)比较发现差异表达基因数30个,上调基因16个,含Y染色体基因10个,常染色体6个;下调基因14个,含X基因2个,其中下调最明显的基因也是XIST,常染色体12个。2.全基因组甲基化结果显示:KS(47,XXY)与正常男性对照组(46,XY)比较甲基化差异基因,结果发现358基因发生甲基化,含X染色体基因252个;KS患者(47,XXY)与正常女性对照组(46,XX)比较发现80个甲基化差异基因,含X染色体基因5个;正常男性对照(46,XY)和正常女性对照(46,XX)发现337个甲基化差异基因,含257个X染色体基因,在三组对比中均未发现Y染色体基因甲基化差异。结论:1.结果显示KS患者与男性对照组比较发现X染色体上差异表达最显著基因XIST表达上调,此基因主要负责启动X染色体失活(XCI),男性对照组与女性对照组比较差异表达最显著基因也是XIST,上述两组XIST|log2Ratio≥1|几乎是一样的,KS患者与正常女性对照组比较XIST log2Ratio值非常小,可以忽略不计,提示我们KS患者多余X染色体和女性失活的X染色体是相同的,属于正常失活,XIST的表达与X染色体的个数有关。2.结果显示男性对照组与女性对照组比较,X染色体上存在2个差异表达显著的基因;KS患者与男性对照组比较,X染色体上存在9个差异表达显著的基因;KS患者与女性对照组比较,X染色体上存在6个差异表达显著的基因;由此得出在KS中多余X染色体差异表达较少,对差异表达显著的X连锁基因进行查询发现其主要与DNA结合或免疫系统相关,而KS不只是免疫系统发生了改变,其表型呈现多样化,这些X染色体基因表达的改变不能充分解释KS多样化的临床表现,因此,提示我们,除了多余X染色体上基因差异表达会影响KS表型外,可能还存在其他影响因素。3.结果显示差异表达显著的基因位于常染色体较多,其中NR4A3是常染色体下调最显著基因,此基因是胰岛素抵抗相关基因,其下调会直接导致2型糖尿病和代谢综合症,由此我们推测NR4A3基因表达的差异可能是KS患者易患2型糖尿病和代谢综合症原因所在,常染色体基因表达差异可能是KS表型多样化的原因之一。4.结果显示在KS中Y染色体基因正常表达,Y染色体基因表达不受多余X染色体的影响,因此造成KS无精子症和少精的原因可能还存在其他作用机制。5.基因甲基化水平影响基因表达水平,甲基化水平高时基因沉默或少量表达。KS中X染色体差异表达显著基因较少而发生甲基化的X染色体基因较多,常染色体差异表达显著基因较多而发生甲基化的常染色体基因却较少,提示我们,甲基化水平的改变可能对KS表型的多样化有影响。

关键词： Klinefelter syndrome RNA表达谱基因组甲基化 XCI 逃逸失活染色质修饰 rrbs