边缘无浆体MSP5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立

作     者：马米玲 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：罗建勋;殷宏

授予年度：2007年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：边缘无浆体 MSP5基因 克隆 原核表达 ELISA 抗体消长 血清学调查 

摘      要：边缘无浆体病是由蜱传播的、边缘无浆体寄生于牛红细胞内所引起的立克氏体病。该病几乎遍布我国各省(区)，严重威胁着养牛业的发展。 本试验根据已发表的MSP5基因序列，设计引物，利用PCR技术自感染边缘无浆体基因组DNA中扩增MSP5基因，通过将产物与pGEM-T Easy载体连接，构建重组克隆载体pGEM-TEasy-MSP5。基因测序结果表明，本试验所获得的MSP5基因核苷酸序列和所编码氨基酸的序列与GenBank中收录的边缘无浆体国外株的同源性分别为98.6％和99％。根据开放阅读框(ORF)两侧序列重新设计并合成表达引物，以重组质粒pGEM-T Easy-MSP5为模板，进行PCR扩增，将扩增产物与pGEX-4T-1质粒连接，构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-MSP5，将其转化到DH5α宿主菌中，用IPTG进行诱导表达，所表达的目的蛋白部分为分泌性表达，大部分呈包涵体。SDS-PAGE和Western-blot分析表明，MSP5基因在大肠杆菌中成功获得了表达，目的蛋白约占菌体总蛋白的35.0％，并与GST形成融合形式，分子量大小为45Ku左右，与预期的大小相吻合，且可被兔抗牛边缘无浆体阳性血清所识别。 通过裂解、洗涤、变性、复性等方法对包涵体蛋白进行处理，以所获得的纯化产物作为抗原，构建了ELISA诊断方法：实验证实，该方法的阳性符合率和阴性符合率分别为100％(100／100)和98％(98／100);对实验感染牛的抗体消长规律进行了观察，结果显示，动物感染后第5天即可查出抗体(滴度为1：50)，第90天时抗体达到高峰(滴度为1：3200)，然后逐渐下降，感染后第5个月抗体效价为1：1600;对自新疆、内蒙古、黑龙江、吉林、四川和甘肃六省区的血清样品进行了检测，阳性率分别为67.63％(700／1035)、81.78％(184／225)、82.78％(149／180)、46.11％(139／180)、66.67％(83／180)和77.22％(90／135)，结果与过去采用病原学检测获得的结果基本一致。上述结果表明，所建立的方法可用于边缘无浆体病的血清学调查。