柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和功能分析

作     者：蔺凌云 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李红叶

授予年度：2010年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：多聚半乳糖醛酸酶 基因表达 基因敲除 基因过表达 果胶酶活性 致病性 

摘      要：果胶酶是植物病原物突破植物细胞壁的主要细胞壁降解酶之一。真菌多聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase,PG）作为主要的果胶酶成员,可以降解植物细胞壁的主要成分同源半乳糖聚糖,在一些真菌和植物互作系统中被证明是真菌的致病因子,决定病菌的致病性,但在另一些互作系统中,单个多聚半乳糖醛酸酶基因的敲除并没有导致病菌致病力的下降。柑橘绿霉病（Penicillum digitatum Sacc.）的互作体系不同于已研究的真菌—植物互作体系,即病菌只能从伤口侵入,只能为害成熟的柑橘果实,寄主不是植物体,是果皮富含果胶并逐渐衰老的离体果实。虽然没有实验证据,但从病害软腐症状判断,水解酶应该参与致病过程。 为证实在柑橘绿霉菌—柑橘这个特殊互作系统中柑橘绿霉菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶是否参与致病过程,本研究根据已报道的柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因（Pdpg1）序列设计合成特异性引物,从基因组DNA中扩增获得Pdpg1的全长基因。氨基酸序列分析表明：Pdpg1与其他真菌如Penicillum olsonii的pgl（79%）和Penicillum griseoroseum的pgl（85%）等具有较高的同源性,其开放阅读框为1101bp,包括3个外显子和2个内含子,编码蛋白的N端有一段长为18个氨基酸的信号肽序列。表达分析表明Pdpg1是一个组成型基因,其表达不受葡萄糖的抑制。Real-time PCR分析结果表明,Pdpg1是一个酸性表达基因,pH 4.0时表达水平最高,大约是pH 7.0的15倍。 论文构建了Pdpg1基因敲除载体ΔPdpg1和过表达载体EX-vector,应用根癌土壤农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法转化柑橘绿霉菌菌株Pdw03,获得的转化子ΔPdpg1-10,ΔPdpg1-38,EX-3,Etc-2经PCR和Southern bloting验证,确定为Pdpg1基因敲除、过表达及异位插入突变体。实验表明,在常规的PDA培养基上,Pdpg1基因敲除和过表达突变体与野生型亲本菌株Pdw03在菌落特征/菌丝生长速率和分生孢子产生上没有显著的不同。但在果胶（诱导）培养基上培养15天,野生型和各突变体均未产孢,敲除突变体的生长速度明显慢于野生型菌株,而过表达及异位插入突变体的生长速度与野生型没有显著性差异。Pdpg1基因敲除突变体的果胶酶活性比野生型降低了26%,过表达突变体的酶活性比野生型提高了26%,插入突变体与野生型非常接近,没有差异。Pdpg1基因敲除和过表达突变体,以及野生型菌株分别刺伤接种柑橘果实,结果显示：敲除突变体,过表达突变体较野生型病斑直径均没有显著性差异。可见,虽然离体条件下,Papg1缺失导致多聚半乳糖醛酸酶分泌的显著下降,Pdpg1基因的过表达导致多聚半乳糖醛酸酶分泌的显著上升,但这些变化并没有直接导致其致病性的下降或者上升。由此推断,单个多聚半乳糖醛酸酶基因在柑橘绿霉菌菌的致病过程并没有起到关键性的作用。