样本处理流程对血液中梅毒螺旋体DNA提取效率的影响

作     者：范瑾依 

作者单位：厦门大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林丽蓉

授予年度：2017年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 100206[医学-皮肤病与性病学] 

主      题：梅毒螺旋体 梅毒 离心力 DNA提取效率 聚合酶链反应 

摘      要：背景:聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)可直接检测梅毒螺旋体(Treponema pallidum subsp.pallidum,T.pallidum),对梅毒进行明确诊断。然而梅毒患者血液样本的T.pallidum-PCR阳性率低,常与临床诊断不符。本研究探讨样本处理流程和血液样本类型对T.pallidum DNA得率的影响,为提高血液T.pallidum-PCR的阳性率提供实验依据。方法:采用自主构建的Tp47基因荧光定量PCR方法检测一系列体外模拟实验样本和感染兔血中的T.pallidum DNA,探讨不同样本处理流程对T.pallidum DNA提取效率的影响:(1)100μL 1×107个/mL菌液分别与抗凝全血以及非抗凝全血混合后,比较去除红细胞处理对全血样本、2000×g离心后下层血球样本(抗凝血)和血块样本(非抗凝血)中T.pallidum DNA得率的影响;(2)1OOμL1×107个/mL菌液与400μL抗凝全血混合后,分别置于4℃和25℃,在放置Oh、2h、6h、12h、24h和48h后提取全血样本中的T.pallidum DNA,明确样本贮存温度和时间对T.pallidum DNA得率的影响;(3)100OμL 1 × 1 07个/mL菌液分别与400μL生理盐水、血清和血浆混合,再分别经500×g、1000×g、2000×g、4000×g、5000×g、7000×g、10000×g和20000×g离心15min后,检测样本上层和下层中T.pallidum DNA的含量,探究离心力对T.pallidum在不同介质中分布的影响;(4)100μL 1 ×107个/mL菌液分别与400μL抗凝全血以及非抗凝全血混合后,再分别经500×g、1000×g、2000×g、4000×g、5000×g、7000×g、10000×g 和 20000×g 离心 15min 后,检测样本上层和下层中T.pallidum DNA的含量,探究离心力对T.pallidum在抗凝全血和非抗凝全血中分布的影响;(5)采用感染兔血样本,比较不同离心力作用下不同血液成分中T.pallidum DNA得率的差异。结果:本研究所构建Tp47基因荧光定量PCR方法的最低检测限为3.41 copies/μL DNA。不同样本处理流程,样本中的T.pallidum DNA的得率存在差异:(1)全血样本和2000×g离心后的下层血球样本经过去除红细胞处理后,样本中T.pallidum DNA的得率分别可提高40.4倍和32.4倍;(2)样本的处理时间(48h内)以及放置温度(4℃和25℃)不影响血液样本中T.pallidum DNA的提取效率;(3)纯介质模拟实验中,随着离心力的增大,混合体系上层中T.pallidum DNA的得率不断减少同时下层中的得率不断增加;(4)抗凝全血模拟实验中,混合体系分别经 500×g、1000×g、2000×g、4000×g、5000×g、7000×g、10000×g 和 20000×g离心后,下层血球中T.pallidum DNA的得率分别为上层血浆中的2.8倍、4.6倍、7.3倍、12.6倍、15.2倍、16.7倍、65.1倍和73.1倍。然而,非抗凝全血实验组在不同的离心操作后,下层血块中T.pallidum DNA的得率仅为1%左右;(5)不同离心力作用下不同感染兔血液成分中T.pallidum DNA的得率与体外模拟实验结果相似。结论:实验结果表明,T.pallidum在各介质中很容易受到离心力的影响而沉降。常规临床工作中的离心操作(2000×g)会使血液样本中大量T.pallidum随着血细胞被离心到管底。通过高速离心操作(20000×g)获得下层血球并进行去除红细胞处理,可提高血液样本中T.pallidum DNA的得率。临床血液样本的PCR检测应使用全血或血球样本,而不是血清、血浆或血块样本。