青岛沿岸自由生活海洋线虫18S核糖体RNA基因扩增及序列变异分析

作     者：沈锡权 

作者单位：中国海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨官品

授予年度：2005年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：海洋线虫 18S核糖体RNA基因 分子鉴定 群落结构 系统学分析 

摘      要：真核生物的核糖体RNA小亚基基因(Ribosomal RNA small subunit gene)是常用的分子标记基因,具有进化速率慢,序列保守性高,拷贝数高的特点,常用在属或更高阶元的系统学研究中。该基因也适合作环境指示基因,用于研究环境样品的种群遗传结构,直接扩增环境微小生物的18SrRNA基因片段,建立18SrRNA基因变异类型文库,在DNA水平上剖析其群落结构组成。该方法是建立在DNA序列分析基础上的,它以环境总DNA为模板进行扩增,回避了线虫挑取和显微镜检过程,对认识自然环境中广泛存在的微小生物的遗传多样性具有重要的意义。本研究的目的是建立一系列分子生物学方法在形态学分类基础上,用核糖体RNA基因序列信息,补充、完善形态分类,进行海洋自由生活线虫的分子系统学和分子遗传多样性分析。 首先根据线虫18S核糖体RNA基因PCR扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇+0.05mol/L EDTA(pH8v.0)和5%海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备PCR模板DNA,而5%海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。在此基础上,研制了一种自由生活海洋线虫个体的形态学和分子生物学相结合的鉴定方法。海洋线虫个体样品经5%福尔马林固定、甘油透明、光学显微镜观察等处理进行形态学鉴定后,碱煮法提取其DNA,用特异性引物扩增部分18SrRNA基因片段,对扩增产物克隆、测序,最终取得分子生物学数据。在形态学鉴定的基础上,同时获得的系统学常用标记基因的序列是分类鉴定的重要补充,也是不同来源数据相互比较的重要基础。 本文以18SrRNA基因为标记基因,对青岛市区沿岸潮间带自由生活海洋线虫的遗传多样性进行了初步研究。取环境泥沙分离自由生活海洋线虫并提取其混合DNA,用线虫特异引物扩增长约1300bp的18S核糖体RNA基因片段,克隆后,随机选139个克隆进行Rsa Ⅰ和Hin6 Ⅰ酶切分析,共检测出17种限制性