甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

作     者：梁建荣 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐云明

授予年度：2011年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：甘薯叶 多酚氧化酶 分离纯化 性质 功能基团 

摘      要：多酚氧化酶(polyphenol oxidase, EC1.***.3.1,简称PPO)是一类广泛存在于植物、动物、微生物等体内的一类铜结合酶。多酚氧化酶在植物体内能够催化酚类物质生成邻醌,醌类再进一步氧化生成褐色素。多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要原因之一,会降低果蔬等的营养价值及经济价值,并影响其风味及品质。此外,多酚氧化酶与植物抗病、植物光合作用、花色形成、乙烯生成等方面都有联系。甘薯叶作为一种耐寒耐贫瘠的绿色蔬菜,含有丰富的矿物质、维生素等,可提高人体抗病能力,有降血糖,抗肿瘤等作用,已引起大家广泛关注。目前,对甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化未见报道。本文以甘薯叶为材料,对多酚氧化酶的分离纯化、酶学性质、抑制剂及功能基团的化学修饰等方面进行了研究,以将甘薯叶的利用价值得到开发,提高其经济效益。主要研究结果如下： 本文通过对新鲜甘薯叶进行组织匀浆、磷酸盐缓冲液抽提得到粗酶,再经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等纯化步骤,最终从甘薯叶中得到了多酚氧化酶的电泳纯制品。纯化得到的酶比活力为50075.43U/mg,纯化倍数为597.99,回收率为0.48%。 理化性质研究表明,甘薯叶多酚氧化酶的全酶的相对分子质量128.6kd,亚基相对分子质量约为64.4kd,可见该酶由两个相同的亚基组成。该酶的最适温度为35℃,在25-55℃内酶有较好的稳定性。最适pH为6.5,在pH6-7内酶较稳定。在最适条件下,以不同浓度的邻苯二酚溶液为底物测得该酶的Km值为0.0445mol/L。 金属离子Ca2+、Hg2+对甘薯叶多酚氧化酶有明显的抑制作用;Pb2+、C02+、Fe2+对甘薯叶多酚氧化酶有明显的激活作用;K+、Mn2+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ba2+对该酶活性基本无影响。 研究有机溶剂对甘薯叶多酚氧化酶的抑制作用,甲醇、乙醇和异丙醇对甘薯叶多酚氧化酶活性抑制强度不同,异丙醇抑制作用最强,乙醇次之,甲醇抑制作用相对最弱。低浓度的抗坏血酸和亚硫酸钠对该酶有强烈的抑制作用,柠檬酸次之,EDTA-2Na的抑制效果相对较弱,尿素对该酶基本无影响。 用化学修饰剂对该酶的功能基团进行修饰,发现二巯基苏糖醇(DTT)和乙酰丙酮(BD)能显著地抑制该酶活性,氯胺-T、NAI对酶有一定的激活作用,BrAc、顺丁烯二酸酐、SUAN、PCMB、PMSF对酶活性影响不大。因此认为甘薯叶多酚氧化酶的必需基团可能包括精氨酸残基和二硫键。