当归多糖对2型糖尿病预防及治疗作用的初步研究
作者单位：华中科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：王凯平
授予年度：2013年
摘 要：糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种由胰岛素抵抗引起的代谢紊乱的内分泌疾病。其中2型糖尿病占90%以上。随着人们生活水平的不断提高，糖尿病的发病率也来越高，对人们的生活质量造成严重影响。近年来由于新药资源的寻找与开发，中药多糖的研究越来越受到重视。据报道约有800种药用植物有降糖作用。当归多糖是中药当归的主要生物活性成分，在抗贫血、抗肝损伤和抗肿瘤等方面具有显著活性，但关于当归多糖降糖作用及其机制的研究甚少。本实验以岷县当归饮片为原料，提取纯化后得到性状稳定的当归多糖，在此基础上分别研究当归多糖对2型糖尿病初步的预防及治疗作用，探究当归多糖新的药理活性。 第一部分当归多糖的提取与纯化 本实验采用岷县当归饮片为原料，经水提醇沉法得到当归粗多糖。多糖溶液经反复冻融去除溶液中不稳定成分，透析去除小分子杂质、单糖和寡糖等水溶性成分，微滤后得到澄清透明的当归多糖溶液，最后经冻干后得到性状稳定的当归多糖。通过测定当归多糖的糖含量、相对分子质量以及紫外扫描进行其纯度鉴定。经过此法制得的当归多糖，经苯酚-硫酸法测得糖含量稳定保持在65%左右。高效凝胶色谱法测得其重均分子质量为9.512×104Da。紫外扫描结果显示当归多糖不含蛋白质和核酸。结果表明此法能制得比较纯净且性状稳定的当归多糖。 第二部分当归多糖对HFD诱导的小鼠前趋糖尿病的预防作用研究 实验采用高脂饮食（HFD）诱导建立胰岛素抵抗的前趋糖尿病小鼠模型。实验小鼠随机分为四组，每组12只。空白对照组（NC）给予普通饲料自由喂养;当归多糖低剂量组（LASP）每天给予400mg/kg当归多糖灌胃，HFD自由喂养;当归多糖高剂量组（HASP）每天给予600mg/kg当归多糖灌胃，HFD自由喂养;阴性对照组（PC）每天灌胃等量的生理盐水，HFD自由喂养。每十天记录一次各组小鼠的体重、空腹血糖（FPG）、血脂变化。四周后测定的血样指标中阴性对照组出现明显的高血糖、高组和HASP组均能显著性降低小鼠的FPG （PC组：7.08mmol/L;LASP组：6.20mmol/L*;HASP：6.87mmol/L*），显著性降低空腹胰岛素FIns（PC组：44.40μIU/mL;LASP组：22.33μIU/mL**;HASP：32.35μIU/mL**），显著性降低胰岛素抵抗指数INRI（PC组：8.76;LASP组：4.22**;HASP：4.69**），对总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)无明显影响。小鼠解剖后迅速切取部分肝脏、胰腺和附睾脂肪，滤纸吸干表面水分后浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定，常规洗涤后进行包埋、切片和HE染色。观察小鼠HE染色的切片发现，PC组小鼠的肝脏、胰岛出现明显的脂肪空洞和变性，脂肪细胞体积变大等胰岛素抵抗的病理形态学特征，LASP组和HASP组均能保护肝脏、胰岛和脂肪组织，缓解HFD导致的胰岛素抵抗。结果表明当归多糖对前趋糖尿病有良好的预防作用。 第三部当归多糖对小鼠2型糖尿病的治疗作用研究 实验采用HFD喂养联合小剂量STZ单次腹腔注射的方法，诱导建立T2DM小鼠模型。随机挑选10只小鼠作为空白对照组（NC），全程普通饲料喂养;其余70只小鼠高脂高糖饲料（HFD）喂养四周后，按照80mg/kg的剂量STZ单次腹腔注射，三天后检测空腹血糖（FPG）有无变化，两周后FPG居高不下并且大于等于11.1mmol/L即为T2DM（type2diabete mellitus）模型组小鼠。模型组小鼠随机分为5组，每组12只，均普通饲料喂养。当归多糖低剂量组(LASP)、中剂量组（MASP）和高剂量组（HASP）每天分别按照100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量灌胃当归多糖，阳性对照组（PC）按照200mg/kg的剂量灌胃二甲双胍，阴性对照组（DC）给予等量的生理盐水。四周后当归多糖各剂量组均能一定程度上降低小鼠的PFG（DC组：26.3mmol/L;LASP组：22.3mmol/L;MASP组：24.0mmol/L;HASP：25.4mmol/L），增加FIns水平（DC组：3.7μIU/mL;LASP组：4.5μIU/mL;MASP组：4.9μIU/mL;HASP：5.0μIU/mL）。小鼠解剖后迅速称量完整的肝脏，计算肝脏指数;切取部分肝脏和胰腺组织，滤纸吸干表面水分后浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定，常规洗涤后进行包埋、切片和HE染色处理;迅速取各组小鼠的肝脏和骨骼肌组织，生理盐水漂洗后滤纸吸干，分装于冻存管中-80℃冻存。通过计算肝脏指数发现当归多糖对前趋糖尿病小鼠的肝脏指数无明显影响。糖原测定结果表明当归多糖各剂量组均能一定程度上增加肌糖原（MG）含量（DC组：1.01mg/g;LASP组：1.06mg/g;MASP组：1.21mg/g*;HASP：1.17mg/g*）;增加肝糖原（HG）含量（DC组：6.68mg/g;LASP组：7.09mg/g;MASP组：8.51mg/g*;HASP：7.55mg/g*）。观察各组小鼠HE染色切片发现，当归多糖各剂量组均能一定程度上缓解肝脏和胰腺的胰岛素抵抗。通过探讨当归多糖缓解胰岛素抵抗的机制研究表明，当归多糖能显著性降低炎症因子IL-6水平（DC组：54.12pg/mL;LASP组：41.59pg/mL**;MASP组：44.48**pg/mL），显著性降低TNF-α水平（DC组：320.09pg/mL;LASP组：242.40pg/mL**;MASP组：255.52pg/mL**;HASP组：298.83pg/mL）。结果表明当归多糖可能通过降低炎症因子TNF-α和IL-6的含量来缓解胰岛素抵抗，继而发挥降糖和增强胰岛素功能的作用。
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