PBDE-209对卵巢癌及仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响

作     者：刘晓燕 

作者单位：广州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陈敦金

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：OVCAR-3细胞 CHO细胞 PBDE-209 增殖 PKCα ERK G(?)6976 PD98059 

摘      要：多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一类含溴原子的芳香族化学物,常作为阻燃剂加到油漆、塑料、纺织、电子电器等产品中,目前已广泛应用于电子、电脑和泡沫等家具中。随着工业的发展,PBDEs在世界范围的需求不断增加,环境中的PBDEs的浓度也逐年增多。有资料显示,发达国家80%的电子垃圾进入中国、印度和巴基斯坦等国,其中中国占了90 %,导致城市的户外空气中PBDEs浓度比农村空气中的10倍还多,在我国一些地区已形成了电子垃圾拆解集散地,原始的拆解手段(露天焚烧、烘烤和酸洗等)使PBDEs等持久性有毒污染物不断向周围释放,严重污染了当地环境,危害人体健康。 由于PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使生物受到毒害,最终导致对人体健康的危害。目前国内外对低溴联苯醚的相关毒性研究较多,而且结果较肯定,从大量动物实验中发现低溴类PBDEs具有肝肾毒性、生殖毒性、甲状腺毒性、神经发育毒性及潜在的致癌性等,因此,在欧盟及美国已禁止使用。而十溴联苯醚(decabrominated PBDE, PBDE-209或DeBDE)的毒性较低溴联苯醚类低,在美国及欧洲仍允许生产使用。我国不但是PBDEs的生产、使用和出口大国,而且还是接收电子垃圾的大国,其中PBDE-209的生产使用量最大,因此PBDE-209已成为我国重要的环境污染物。PBDE-209在环境中可以经光解、高温分解、生物及微生物降解等过程,转化成溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃及低溴代的联苯醚,更容易进入生物体,引起更强的毒性作用。但是,关于PBDE-209对机体是否存在危害仍有很多争议,研究证明PBDE-209具有神经发育毒性,免疫毒性,内分泌毒性以及致癌性;动物试验证实PBDE-209有胎毒性,在孕期接触PBDE-209,能使雄性子鼠的生殖功能受损。 近年来卵巢癌发病率呈持续上升趋势,是女性死亡率最高的生殖系统恶性肿瘤。目前卵巢癌病因尚未明确,但遗传因素和环境因素交互作用对卵巢癌的影响已引起人们的关注。PBDE-209可影响女性生殖系统及内分泌水平(激素),而环境中日益增高的PBDE-209浓度与女性生殖系统肿瘤发病率的升高目前并无相关的报道。因此,本课题从细胞水平出发,深入研究PBDE-209对体外培养的卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞和中国仓鼠卵巢上皮细胞株CHO细胞增殖的影响,观察低浓度PBDE-209暴露对癌细胞的增殖以及对细胞周期的影响,并初步探讨在这一过程中信号转导通路PKCα-ERK的磷酸化变化。 第一部分PBDE-209对卵巢癌细胞和仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响 【目的】 观察低浓度PBDE-209暴露引起OVCAR-3和CHO细胞形态学改变;MTT法检测细胞生物活性的变化;免疫荧光化学检测增殖细胞核抗原Ki67的表达变化;并用流式细胞术检测PBDE-209引起的细胞周期的分布变化。 【实验方法】 (1)贴壁培养OVCAR-3和CHO细胞,连续计数接种后0-7天的细胞数,描绘三种细胞株的细胞生长曲线,并计算细胞群体倍增时间。 (2)取复苏后2-3代OVCAR-3和CHO细胞为实验细胞,饥饿同步化处理后,加入不同浓度PBDE-209作用不同时间(0-72h),观察细胞生长形态变化;并用MTT法测定细胞吸光度值,计算细胞增殖率变化。 (3)用免疫荧光化学方法,观察不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后Ki67的表达变化。 (4)用流式细胞术检测不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后,细胞周期分布变化。 【结果】 (1)卵巢癌细胞株和仓鼠卵巢上皮细胞株在生长形态和特点上完全不同:OVCAR-3细胞胞体接近椭圆形且形态不规则,呈集落样生长,接触性抑制较差,细胞群体倍增时间是36.74±1.29 h;而CHO细胞胞体呈梭形,亦呈集落样生长,耐饥饿能力差,细胞群体倍增时间是40.56±1.25h。 (2)随着PBDE-209作用时间的延长以及浓度的升高,细胞增殖明显,细胞间隙变小。MTT检测发现,PBDE-209引起两种细胞株细胞增殖率变化呈现时间依赖和浓度依赖效应。50nM作用于OVCAR-3细胞24h即可以引起细胞的增殖;作用48h时使细胞增殖率增加1.53倍;而72h的暴露可以引起细胞1.75倍的增殖变化。而CHO细胞对PBDE-209的反应相对较轻,100nM PBDE-209作用48h和72h时细胞增殖率分别为1.47倍和1.51倍,弱于OVCAR-3细胞。 (3)免疫荧光化学观察发现0-100nM PBDE-209作用72h时,可以引起Ki67阳性细胞百分率变化呈现浓度依赖效应。25nM、50nM和100nM PBDE-20