miR-98通过IKKε调控NF-κB通路在胶质瘤侵袭中的作用及机制研究

作     者：范阳华 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：祝新根

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：miR-98 IKKε NF-κB p65 人脑胶质瘤 

摘      要：目的本研究以不同病理级别的胶质瘤组织和U87、U251脑胶质瘤细胞为实验对象,检测miR-98与IKKε在脑胶质瘤组织及细胞中的表达及其相关性,进一步探讨miR-98介导IKKε/NF-κB通路的调控机制及与脑胶质瘤侵袭性生物学行为的关系,以期为胶质瘤的防治提供新的思路。方法1.第一步通过Real-Time PCR、Western blot方法检测53例脑胶质瘤标本、10例正常脑组织标本及胶质瘤细胞中的miR-98与IKKε、NF-κB p65的表达水平,初步探究分析miR-98与IKKε、NF-κB在脑胶质瘤组织中表达的相关性。2.第二步采用荧光素酶实验:检测miR-98与IKKε之间的调控关系。3.第三步研究人脑胶质瘤细胞转染miR-98 mimics后对胶质瘤细胞侵袭的影响及IKKε/NF-κB表达的体外研究,并初步探讨其潜在机制。a.采用miR-98 mimics转染U87及U251胶质瘤细胞,采用Real time PCR检测miR-98及IKKε、MMP-9 m RNA的表达,采用Western blot检测IKKε、细胞总NF-κB p65及细胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表达;b.Transwell实验检测转染miR-98 mimics后侵袭能力的改变,划痕实验评价转染miR-98 mimics后细胞迁移能力的改变。4.第四步研究在脑胶质瘤中IKKε及NF-κB p65在miR-98调控中的作用的体外研究,并进一步验证其机制a.pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测IKKε、MMP-9、细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况。采用Real time PCR检测IKKε、MMP-9 m RNA的表达;b.Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。c.pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。结果1、脑胶质瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表达相关性a.miR-98表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈负相关;IKKε、NF-κB P65表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈正相关。b.miR-98与IKKε表达水平呈密切负相关(r2=0.7223,p0.05),miR-98与NF-κB P65表达水平呈密切负相关(r2=0.6337,p0.05);NF-κB P65与IKKε表达水平呈密切正相关(r2=0.6123,p0.05)2、U251、U87细胞较HEB细胞miR-98表达下降,IKKε表达增高;荧光素酶实验显示:转染miR-98 mimics后,IKKε-WT报告载体的荧光强度受到显著抑制;而IKKε-MUT报告载体的荧光强度基本不变,说明IKKεm RNA的3’UTR上存在miR-98的结合位点,证实IKKε是miR-98下游靶基因。3、转染miR-98 mimics发现:a.上调miR-98能够有效抑制脑胶质瘤侵袭与迁移能力。b.上调miR-98表达能够下调IKKε的表达水平及抑制NF-κB p65从细胞质到细胞核的转座,从而调控NF-κB通路及抑制MMP-9的表达水平,而不影响NF-κB p65在细胞中的总含量。4、转染pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics发现:a.上调IKKε能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力;b.上调IKKε能恢复NF-κB p65的转座从而调控NF-κB通路及恢复MMP-9的表达水平。5、转染IKKεsi RNA+miR-98 mimics与IKKεsi RNA+miR-98 inhibitor发现:抑制IKKε表达后miR-98 mimics及miR-98 inhibitor对NF-κB p65的转座及MMP-9的表达无差别。6、转染pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics发现:上调NF-κB p65能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力结论miR-98可以通过IKKε基因调控NF-κB通路,影响脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力。miR-98在胶质瘤中作为一个抑癌基因并可做为潜在治疗脑胶质瘤的分子靶点。