脾脏巨噬细胞在凋亡细胞诱导的免疫反应中的作用的初步研究

作     者：杨春青 

作者单位：泰山医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：宋文刚;唐华

授予年度：2013年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：凋亡细胞 巨噬细胞 树突状细胞 免疫应答 

摘      要：目的 探讨巨噬细胞和树突状细胞吞噬凋亡细胞后在机体免疫反应中的相互影响，阐明小鼠脾脏巨噬细胞在凋亡细胞诱导的机体免疫应答中的作用，为进一步阐明细胞凋亡在机体免疫自稳和免疫调控中的重要作用机制奠定基础。 研究方法 1.40Gy的X射线辐照剂量诱导小鼠脾脏免疫细胞凋亡，Annexin-V-FITC与PI双标记法检测细胞凋亡率。 2.用二醋酸羧基荧光素（CFSE）标记凋亡细胞，尾静脉回输小鼠后于0.5小时、1小时、2小时分别取其脾脏，用流式细胞仪检测小鼠脾脏免疫细胞吞噬凋亡细胞的能力和吞噬凋亡细胞的免疫细胞亚群。 3.激光共聚焦显微技术观察小鼠脾脏冰冻切片中巨噬细胞和树突状细胞吞噬凋亡细胞的现象。 4.氯磷酸二钠脂质体（clodronate liposomes，CLs）清除小鼠脾脏巨噬细胞，流式细胞仪检测注射CLs后第1天及第5天其脾脏与外周血中免疫细胞的清除率。 5.清除脾脏巨噬细胞后，尾静脉回输CD4+T细胞和凋亡细胞，流式细胞仪检测巨噬细胞在凋亡细胞诱导的抗原特异性CD4+T细胞的免疫反应中的作用。 结果 1.观察到40Gy的X射线辐照剂量可以诱导细胞凋亡，诱导的凋亡细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养2小时之后检测其细胞凋亡率，早期凋亡率为45.7%，晚期凋亡率为12.4%。 2.发现了小鼠脾脏免疫细胞具有吞噬凋亡细胞的能力，且在回输凋亡细胞后1h脾脏免疫细胞的吞噬率最高（吞噬凋亡细胞的免疫细胞占脾脏中所有免疫细胞的0.14%），其中巨噬细胞所占比例最大;树突状细胞也具有吞噬凋亡细胞的能力，其中淋巴样树突状细胞的吞噬率约是髓样树突状细胞的3倍。 3.小鼠尾静脉注射CLs后第1天，与未注射CLs组相比较，外周血中被清除掉的免疫细胞主要是单核细胞（p0.001），脾脏中清除最彻底的是F4/80+巨噬细胞（p0.001），淋巴样树突状细胞的清除率也较高（p0.001）。注射CLs后第5天，除F4/80+巨噬细胞外，其它被清除掉的免疫细胞基本已回复正常水平。说明CLs可以有效清除小鼠脾脏巨噬细胞。 4.清除脾脏巨噬细胞后，树突状细胞具有提呈凋亡细胞相关抗原的功能，但凋亡细胞诱导的抗原特异性CD4+T细胞的免疫应答能力比清除巨噬细胞前降低了约50%（p0.001），提示巨噬细胞参与了抗原提呈过程。 结论 1. CLs能有效清除小鼠脾脏巨噬细胞，注射CLs后第5天是区分巨噬细胞与DC吞噬凋亡细胞的最佳时间点。 2.巨噬细胞参与了凋亡细胞诱导的机体免疫应答过程。 3.上述实验结果丰富了对巨噬细胞在凋亡细胞诱导的免疫反应中的作用的认识，为今后进一步研究巨噬细胞在凋亡细胞诱导的免疫反应中的作用机制提供了理论基础。