HIF-1对H9c2心肌细胞新基因Mipu1表达的影响及其机制研究

作     者：雷坚 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王慷慨

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：缺氧诱导因子-1 Mipu1 氯化钴 H9c2 

摘      要：缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是调节与缺氧反应相关基因表达的最重要作用的转录因子。HIF-1由组成型表达的α和β两个亚单位构成,其α亚单位(HIF-1α)为HIF-1的活性亚基和调节亚基。研究表明,采用氯化钴(cobalt chloride,CoCl)诱导或HIF-1α基因转染等使HIF-1α表达上调的方法可保护心肌免于缺血或缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)引起的损伤。并且越来越多的证据表明,HIF-1参与了缺血预适应(ischemic preconditioning,IP)对心肌的保护作用。HIF-1调节心肌细胞在缺血/再灌注过程生存的机制目前还不十分清楚,可能与其激活心肌保护相关基因的表达有关。Mipul是我室采用大鼠心肌缺血预适应动物模型筛选到的一个新基因,命名为心肌缺血预适应表达上调蛋白(Myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 1,Mipul,又名Znf667),该基因是一个锌指型核转录抑制因子。采用生物信息学分析发现,在Mipul的启动子区含有一个HIF-1保守的缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE),提示HIF-1可能是Mipul的上游调控因子。本研究旨在首次探讨HIF-1对新基因Mipul表达的影响并揭示其可能的调控机制。 本课题以大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞为研究对象,将H9c2细胞随机分成5个组:(1)对照组(Ctrl):以PBS(phosphate buffersolution)处理细胞;(2)CoCl组(Co):以200μmol/L CoCl处理细胞12h;(3)空载体组(Neo):以pEF-BOS空载体瞬时转染细胞;(4)HIF-1α过表达组(HIF):以表达人HIF-1α全长的质粒pEF-BOS-HIF-1α瞬时转染细胞;(5)HIF-1α过表达加CoCl组(HIF+Co):HIF-1α过表达质粒瞬时转染,同时以200μmol/L CoCl处理细胞12h。采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)观察H9c2细胞HIF-1αmRNA的表达情况;进一步的机制研究,采用间接免疫荧光技术观察HIF-1α蛋白在H9c2细胞的分布及表达情况;然后以RT-PCR和Western Blot观察HIF-1α表达上调对Mipul表达的影响;采用荧光素酶报告基因检测HIF-1α表达上调对Mipul启动子转录活性的影响;采用凝胶电泳迁移率分析(electrophoreticmobility shift assays,EMSA)及supershift观察HIF-1是否与Mipul启动子区的HRE直接结合。 结果显示: (1)CoCl组HIF-1αmRNA水平没有明显变化(p0.05 vs Ctrl),HIF-1α过表达组HIF-1αmRNA水平明显增高(p0.05 vs Neo),HIF-1α过表达加CoCl组HIF-1αmRNA的水平没有明显变化(p0.05 vsHIF);(2)对照组HIF-1α蛋白分布于H9c2细胞的胞浆及胞核。CoCl组、HIF-1α过表达组及两者联合处理组细胞内HIF-1α蛋白的表达均明显增多,并且由细胞浆向细胞核移位;(3)CoCl组和HIF-1α过表达组Mipul mRNA和蛋白的表达均明显增高(p0.05,Co vs Ctrl;p0.05,HIF vs Neo),HIF-1α过表达加CoCl组Mipul的表达没有明显变化(p0.05 vs HIF);(4)CoCl组和HIF-1α过表达组Mipul启动子的转录活性均明显增高(p0.01,Co vs Ctrl;p0.01,HIF vs Neo),HIF-1α过表达加CoCl组的Mipul启动子的转录活性没有明显变化(p0.05 vs HIF);(5)HIF-1可直接与Mipul启动子区的HRE结合。 综上所述,可得出如下结论:(1)HIF-1通过与Mipul启动子区的HRE结合促进H9c2细胞Mipul的表达;(2)CoCl通过诱导HIF-1α的蛋白表达促进H9c2细胞Mipul的表达。