S1P1特异性受体激动剂CYM-5442在异基因造血干细胞移植后急性GVHD中的作用及其机制研究

作     者：程巧 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘海燕

授予年度：2014年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：S1P S1P受体激动剂 aGVHD 巨噬细胞 T细胞 内皮细胞 趋化因子 单核细胞 

摘      要：第一部分CYM-5442在异基因造血干细胞移植后急性GVHD中的作用 目的：探讨S1P1特异性受体激动剂CYM-5442在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病（acute GVHD, aGVHD）进程中的作用。 方法：BALB/c （H2Kd）受体鼠接受750cGy全身性致死性辐照，4小时后通过尾静脉注射的方法输注1×107C57BL/6（H2Kb）小鼠来源的骨髓细胞和5×106全脾细胞，建立aGVHD模型。从移植前第1天（day-1）至移植后第4天（day4）每天给小鼠腹腔注射CYM-5442（3mg/kg）或等体积对照组溶剂，观察小鼠生存和体重变化，记录aGVHD积分，并对各aGVHD靶器官进行病理学分析。移植后第4天采用流式细胞术检测两组小鼠的脾脏、肝脏、肺和小肠四个脏器中的免疫细胞的表型。第3天给移植后小鼠腹腔注射EdU（100μg/小鼠），24h后收集小鼠脾脏、肝脏、肺和小肠，检测这四个脏器中CD3+T细胞、CD4+T细胞以及巨噬细胞的增殖。 结果：CYM-5442能显著抑制异基因造血干细胞移植后aGVHD的发生发展但不能完全阻止aGVHD的发生：（1）CYM-5442显著延长aGVHD相关存活;（2）减轻aGVHD相关的体重减少;（3）显著降低aGVHD临床积分。HE染色切片结果显示：对照组肝窦中巨噬细胞浸润比CYM-5442组多;肺的对照组毛细血管管腔充血严重，而CYM-5442组肺泡腔和支气管结构完整;对照组的小肠黏膜细胞上皮细胞脱落，结构不完整，而CYM-5442组小肠黏膜上皮细胞结构完整，无脱落。流式结果显示CYM-5442并不影响T细胞的迁移，但能减少T细胞的活化;CYM-5442显著下调GVHD靶器官中巨噬细胞的百分比和数量，体内EdU增殖实验显示CYM-5442并不影响巨噬细胞的增殖，证明CYM-5442抑制巨噬细胞向aGVHD靶器官中迁移。 结论：CYM-5442能显著抑制aGVHD的发生发展但不能完全阻止其发生，其机制可能是通过抑制巨噬细胞向各aGVHD靶器官中迁移，从而影响到T细胞的活化。 第二部分CYM-5442对内皮细胞趋化因子表达水平及对单核细胞迁移的影响 目的：体外探讨CYM-5442影响单核细胞迁移，从而影响aGVHD进程的机制。 方法：HUVEC细胞以5×106/孔铺于6孔板中，于37℃5%CO2条件下培养过夜，然后用CYM-5442（0.1μM,1μM,10μM）或者DMSO处理细胞，于37℃5%CO2条件下培养24小时。收集细胞用PBS洗2次，加入TRiZol （Invitrogen, Carlsbad,CA）按照操作说明书抽提总RNA，然后逆转录成cDNA。我们采用Power SYBRGreen Master Mix （Applied Biosystems, Warrington, UK）实时荧光定量PCR的方法来检测CCL2和CCL7在mRNA水平上的变化。从人的外周血中分离CD14+单核细胞，分别用CCR2拮抗剂RS102895或者培养基于37℃5%CO2条件下孵育30分钟，然后用培养基洗3次，以200μL体积铺于Transwell24孔板的小室中。小室的下层铺500μL分别用DMSO或者CYM-5442（0.1μM,1μM,10μM）孵育24小时后收集的HUVEC细胞上清。37℃5%CO2条件下培养16小时，然后计数穿过小室膜进入下层的单核细胞的数量。 结果：CYM-5442能显著下调HUVEC细胞中CCL2和CCL7的表达，而不影响CXCL1和CXCL5的表达。CYM-5442处理过的内皮细胞上清趋化单核细胞的数量跟对照组相比显著减少;通过CCR2受体拮抗剂RS102895阻断单核细胞表面的CCR2受体，能显著减少单核细胞迁移的数量。 结论：CYM-5442通过抑制内皮细胞趋化因子CCL2和CCL7的分泌，从而减少单核细胞的迁移，这可能是CYM-5442减少靶器官巨噬细胞数量，从而影响GVHD进程的机制。