牙髓卟啉单胞菌内毒素诱导成骨细胞表达IL-1βmRNA和IL-6 mRNA及其相关信号通路的研究

作     者：杨谛 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：仇丽鸿

授予年度：2009年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙髓卟啉单胞菌 内毒素 成骨细胞 白介素-1βmRNA 白介素-6 mRNA 细胞外信号调节激酶1/2 p38丝裂原活化蛋白激酶 

摘      要：目的 慢性根尖周病变的患牙根管为感染根管,其中牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.e)几乎只在感染根管内出现,且检出率较高,被认为是牙髓感染的特有病原菌。在骨组织改建过程中,成骨细胞的生物学行为至关重要,它既可以分泌基质形成骨组织,又可以产生炎症因子,加速破骨细胞的骨吸收。本实验旨在研究P.e内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)对成骨细胞表达白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的影响,以及可能依赖的信号转导通路,探讨P.e-LPS参与根尖周病变牙槽骨吸收的可能病理机制,为临床治疗奠定理论和实验基础。 材料与方法 1、细菌培养 应用脑心浸液(Brain heart infusion,BHI)固体培养基在37℃、厌氧条件(含80%N、10%CO、10%H)下复苏培养P.e,BHI液体培养基增菌后收集细菌,-20℃保存。 2、内毒素提取 采用热酚水方法提取P.e-LPS,应用经典的凝胶鲎试剂方法对所提取的内毒素进行定性分析。 3、细胞培养 MG63成骨细胞生长于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的RPMI1640培养基中,置于含5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。选择生长状态良好的第3、4代细胞用于实验。 4、实验分组 实验分为剂量组、时间组和加入抑制剂组。剂量组为终浓度分别为0、1、5、10、20、50μg/ml的P.e-LPS作用于MG63成骨细胞6h;时间组为终浓度为10μg/ml的P.e-LPS分别作用于细胞0、1、3、6、12、24h;加入抑制剂组为细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase,ERK)1/2激酶抑制剂PD98059和p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制剂SB203580预处理MG63成骨细胞1h后,加入终浓度为10μg/ml的P.e-LPS,继续培养6h。收集细胞,-80℃保存。 5、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表达水平的检测 提取各组细胞的总RNA,应用随机引物反转录反应合成cDNA,聚合酶链式反应(Polymerase Chain reaction,PCR)反应扩增IL-1β、IL-6和β-actin基因的表达,1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像处理系统得到IL-1β、IL-6和β-actin的平均灰度值。 6、统计学分析 所有实验数据应用SPSS11.0软件包建立数据库,进行单因素方差分析和Dunnett-t检验。显著水平:P0.05时有显著性差异,P0.01时有高度显著性差异。 结果 1、当P.e-LPS浓度为0μg/ml时,MG63细胞表达少量IL-6 mRNA,不表达IL-1βmRNA,与0μg/ml组比较,1、5、10、20、50μg/ml组P.e-LPS诱导成骨细胞IL-1βmRNA和IL-6 mRNA的表达水平均有显著提高,且有统计学差异(P0.01)。 2、根据剂量组实验结果,选择10μg/ml的P.e-LPS分别作用于MG63细胞0、1、3、6、12、24h,随着作用时间的增加,IL-1βmRNA和IL-6 mRNA的表达水平均显著增加(P0.01)。 3、ERK1/2激酶抑制剂PD98059预处理MG63细胞1h,P.e-LPS诱导的MG63细胞表达IL-1βmRNA水平下降。 4、p38 MAPK抑制剂SB203580预处理MG63细胞1h,P.e-LPS诱导的MG63细胞表达IL-1βmRNA和IL-6 mRNA水平均下降。 结论 1、P.e-LPS诱导MG63细胞表达IL-1βmRNA和IL-6 mRNA具有剂量依赖性。 2、P.e-LPS诱导MG63细胞表达IL-1βmRNA和IL-6 mRNA具有时间依赖性。 3、P.e-LPS诱导MG63细胞表达IL-1βmRNA可能依赖ERK1/2和p38MAPK信号转导通路。 4、P.e-LPS诱导MG63细胞表达IL-6 mRNA可能依赖p38MAPK信号转导通路。