桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶活性分析及其基因CDs区的克隆与表达

作     者：徐伟佳 韩卫杰 李旺 陈玉林 XU Wei-jia;HAN Wei-jie;LI Wang;CHEN Yu-lin

作者机构：西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 

出 版 物：《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 (Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition))

年 卷 期：2011年第39卷第1期

页      面：29-35页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 090601[农学-基础兽医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：农业部现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-40) 

主　　题：桑天牛 内切β-1,4-葡聚糖酶 内切β-1,4-葡聚糖酶基因 克隆 表达 

摘      要：【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠（CMC-Na）测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物,扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区,构建原核表达载体pET-APEG,并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH为4.4~5.6,pH值为5.0时酶活性最高;最适温度为30~50℃,50℃时酶活最高;酶液在37℃稳定性好,而在60℃的水浴中处理30 min,酶活性急剧下降。桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区长度为978 bp,编码325个氨基酸残基;BLAST结果显示,该基因序列与黄星天牛属于GHF5的纤维素酶基因序列相似性达85%,氨基酸序列相似性达90%,与已报道的桑天牛Ag-EaseⅢ的序列相似性达98%,氨基酸序列相似性达99%;构建原核表达载体pET-APEG在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE检测结果表明,诱导表达沉淀在约55 ku处有1条特异蛋白条带,与预测蛋白的分子量相符。【结论】陕南地区桑天牛β-1,4-葡聚糖酶为内切葡聚糖酶,属于GHF5家族,其可以在大肠杆菌中表达。