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桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶活性分析及其基因CDs区的克隆与表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2011年第1期39卷 29-35页

作者：徐伟佳韩卫杰李旺陈玉林西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003

【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠（CMC-Na）测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1... 详细信息

【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠（CMC-Na）测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物,扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区,构建原核表达载体pET-APEG,并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH为4.4~5.6,pH值为5.0时酶活性最高;最适温度为30~50℃,50℃时酶活最高;酶液在37℃稳定性好,而在60℃的水浴中处理30 min,酶活性急剧下降。桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区长度为978 bp,编码325个氨基酸残基;BLAST结果显示,该基因序列与黄星天牛属于GHF5的纤维素酶基因序列相似性达85%,氨基酸序列相似性达90%,与已报道的桑天牛Ag-EaseⅢ的序列相似性达98%,氨基酸序列相似性达99%;构建原核表达载体pET-APEG在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE检测结果表明,诱导表达沉淀在约55 ku处有1条特异蛋白条带,与预测蛋白的分子量相符。【结论】陕南地区桑天牛β-1,4-葡聚糖酶为内切葡聚糖酶,属于GHF5家族,其可以在大肠杆菌中表达。

关键词：桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆表达

Thermobifida fusca内切β-1，4-葡聚糖酶的克隆表达及应用研究

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Thermobifida fusca内切β-1，4-葡聚糖酶的克隆表达及应用研究

作者：闫鹏安江南大学

学位级别：硕士

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC3.***.1.4)，又名内切纤维素酶，是纤维素酶系中的重要组成部分，能随机水解纤维素的β-1,4-葡萄糖苷键，产生纤维低聚糖，目前广泛应用于饲料、食品、纺织和洗涤等工业。此外，内切纤维素酶可以非专一性水解壳聚... 详细信息

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC3.***.1.4)，又名内切纤维素酶，是纤维素酶系中的重要组成部分，能随机水解纤维素的β-1,4-葡萄糖苷键，产生纤维低聚糖，目前广泛应用于饲料、食品、纺织和洗涤等工业。此外，内切纤维素酶可以非专一性水解壳聚糖，生成功能性低聚糖——壳寡糖(Chitosan oligosaccharides, COS)。本研究主要对Thermobifida fusca内切β-1,4-葡聚糖酶Cel5A进行克隆，并在大肠杆菌宿主中表达，研究了重组酶的酶学性质，并利用重组酶进行壳寡糖的制备。主要研究结果如下： (1)实现了Cel5A在大肠杆菌中的克隆表达。将来源于T. fusca的内切β-1,4-葡聚糖酶Cel5A，以T. fusca基因组DNA为模板，通过PCR的方法成功扩增，获得全长1293bp的cel5A基因。构建了重组表达质粒pET-24a(+)/pelB-cel5A，并将其转化宿主菌E. coli BL21(DE3)。重组菌在TB培养基中发酵48h后，胞外酶活为46.8IU/mL。 (2)在摇瓶及3L罐水平上对重组菌的发酵培养进行研究。优化后的摇瓶发酵培养基为甘油16g/L，酵母粉45g/L，磷酸盐30mmol/L，Mg4mmol/L，胞外酶活为72.6IU/mL，相对于优化前提升了55%左右。在此基础上，将重组菌在3L发酵罐上进行了小试实验，酶外酶活最高达到172.8IU/mL，总酶活(胞外酶活与周质空间酶活之和)为656.6IU/mL，生产强度达到18.8IU/(mL·h)，分别是TB摇瓶发酵的14倍和19倍，是重组S. lividans的82倍，为现有报道T. fusca来源Cel5A酶活的最高水平。 (3)将重组Cel5A进行分离纯化，并研究了重组Cel5A的相关酶学性质。经过硫酸铵盐析、阴离子层析和凝胶层析后得到电泳纯的重组酶液，并研究了重组酶的酶学性质。重组酶的最适温度为80℃，在50℃和60℃下均具有良好的热稳定性;重组酶的最适pH为5.5， pH稳定范围较宽;Ca等金属离子对重组酶未见有明显的激活与抑制作用;在50℃，pH5.5条件下，以CMC为底物，Km和Vmax分别为5.1mg/mL和48.7IU/mg;重组Cel5A在洗涤剂常用的表面活性剂中具有良好的稳定性，通过PyMOL软件对重组Cel5A的催化结构域进行了表面静电势分析，推测了其在表面活性剂环境中稳定的分子基础。 (4)考察了重组Cel5A水解壳聚糖制备壳寡糖的效果。通过对酶解液的质谱分析确定了重组Cel5A具有水解壳聚糖制备壳寡糖的能力，初步建立了利用HPLC-ELSD法分离检测壳寡糖产物的方法。确定了重组Cel5A水解壳聚糖的最优条件为底物浓度30g/L，温度50℃，加酶量2IU/g底物，反应1h，可获得聚合度为3的壳寡糖，转化率为60.3%。

关键词：内切β-1,4-葡聚糖酶大肠杆菌克隆表达发酵优化壳寡糖

硫化叶菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆、表达与功能分析

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硫化叶菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆、表达...

作者：朱泾华中农业大学

学位级别：硕士

β-甘露聚糖酶和内切p-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求,对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。木研究的主要目的是,从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值的嗜... 详细信息

β-甘露聚糖酶和内切p-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求,对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。木研究的主要目的是,从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值的嗜热酶,尝试利用冰岛硫化叶菌蛋白表达系统,探索这些嗜热酶在工业化应用中的可行性。本研究获得如下结果：(1)利用PCR技术从冰岛硫化叶菌REY15A (S. islandicus Rey15A)中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的内切p-1,4-内切葡聚糖酶基因(Sis eng),并将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至*** E233S (△pyrEF△lacS)。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG-W)分子量为41 ku,带有信号肽的分子量(ENG-SP)为43 ku。酶学性质分析表明前者没有酶活性;后者酶活力为103.4 U/L,最适反应温度为90℃,最适pH为4.0,耐热性实验结果表明在90℃保温60 min后酶活力稳定在最高酶活力的40%以上;金属离子实验结果表明,终浓度为1mmol/L的Mn2+对重组酶促进作用最大,使其酶活力提高了约59%,终浓度为1mmol/L的Ca2+对其抑制作用最强,使其酶活力下降至43%。(2)利用PCR技术从硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)中扩增得到内切甘露聚糖酶基因,并将其分别克隆至大肠杆菌表达载体pET-30α和硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pET-30α-3007和pZC2-3007,并分别转化至E. coli Rosetta和*** E233S(△pyrEF△lacS)菌中。利用IPTG诱导重组菌株*** Rosetta/pET-30α-3007, SDS-PAGE检测表明目的蛋白大部分以包涵体形式存在且分子量大小为70 ku,与预测一致;对其进行包涵体复性后过Ni-NTA柱纯化得到目的蛋白3007-R。重组菌株S. islandicus E233S/pZC2-3007经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白3007-S。酶学性质分析表明重组蛋白3007-R和3007-S均没有甘露聚糖酶活性,实验结果证实在此实验条件下Sso3007不具有NCBI上预测的甘露聚糖酶活性。质谱分析重组蛋白3007-S,结果表明基因序列均全部表达。

关键词：硫化叶菌甘露聚糖酶内切β-1,4-葡聚糖酶 DNS法表达

吡咯伯克霍尔德氏菌GH8内切β-1，4-葡聚糖酶的原核表达及其性质研究

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吡咯伯克霍尔德氏菌GH8内切β-1，4-葡聚糖酶的原核表达及其性质...

作者：胡晓晴集美大学

学位级别：硕士

随着生物技术的发展,利用酶法解决农业废弃物问题已成为研究热点之一。内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanse,EC 3.***.1.4,简称EG)属于糖基水解酶类,作用于β-1,4-葡聚糖苷键,在纤维素降解过程中起着至关重要的作用。目前已有不少E... 详细信息

随着生物技术的发展,利用酶法解决农业废弃物问题已成为研究热点之一。内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanse,EC 3.***.1.4,简称EG)属于糖基水解酶类,作用于β-1,4-葡聚糖苷键,在纤维素降解过程中起着至关重要的作用。目前已有不少EG被成功表达,但仍存在酶活力低、酶学性质无法满足工业需求等问题。糖苷水解酶8家族(GH8)内切葡聚糖酶具有广泛的底物特异性,在各种工业应用中都极具吸引力。为此,本研究以来源于吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)的GH8内切β-1,4-葡聚糖酶为研究对象,在大肠杆菌BL21中进行可溶性表达,并对其酶学性质进行较系统的研究,主要结论如下:(1)以吡咯伯克霍尔德氏菌基因组为模板扩增得到编码内切β-1,4-葡聚糖酶的基因Bp EG01790。该基因片段开放阅读框(ORF)为1218 bp(G+C含量为50%),编码406个氨基酸(AA)残基,其中前40位为信号肽,其预测分子量和p I分别为43.0 k Da和9.50。Bp EG01790与GH8的酶具有90%以上的相似性,与来源于吡咯伯克霍尔德氏菌的GH8纤维素酶的同源性最高为98.28%。同时,多序列比对结果显示氨基酸残基E84和D145为催化中心,与GH8酶高度保守的催化活性位点一致。(2)将该基因克隆到p ET-28(+)表达载体,结果显示未实现可溶性表达。更换p Cold TF表达载体后成功实现了可溶性表达,且切除信号肽后的重组工程菌株产酶水平更高。(3)利用Plackett-Burman设计结合响应面法优化了产酶条件,产酶水平由3.1 U/m L提高到39.9 U/m L。确定最终产酶条件:初始p H5.9、诱导时机10 h、诱导时间12 h、IPTG终浓度为0.12 m M、摇床转速为200 rpm、诱导温度为20℃、接种量为1%。(4)利用亲和层析和离子交换层析完成了EG的纯化。酶学性质研究结果显示EG的最优p H为6.0,在p H6.0-8.0范围内残余酶活保持在90%以上,处于相对稳定状态。最优温度为40-45℃,该酶在10℃表现出30%左右的活性(相对于最高酶活)。当温度超过25℃残余酶活急剧下降,属于冷适应性酶。EG具有严格的底物特异性,可将葡聚糖降解为低聚寡糖,在葡寡糖的生产中具有良好的应用前景。本研究实现了源于吡咯伯克霍尔德氏菌GH8内切β-1,4-葡聚糖酶在原核体系中的可溶性表达,进一步扩充了GH8 EG家族,较系统的考察了其酶学特性,为工用酶提供了更多的选择。同时,利用生物酶法处理农业废弃物,高效环保且提高附加值和利用率,解决了环境问题。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌 GH8 内切β-1,4-葡聚糖酶冷适应酶

内切β-1,4-葡聚糖酶的异源表达及其水解制备黄原胶寡糖

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内切β-1,4-葡聚糖酶的异源表达及其水解制备黄原胶寡糖

作者：许颖江南大学

学位级别：硕士

黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产的一种复杂胞外多糖。自1968年获得“公认安全”(GRAS)批准以来,由于其独特的流变性能以及良好的稳定和增稠效果,黄原胶作为食品添加剂的应用越来越广泛。通过水解黄原胶制备的黄... 详细信息

黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产的一种复杂胞外多糖。自1968年获得“公认安全”(GRAS)批准以来,由于其独特的流变性能以及良好的稳定和增稠效果,黄原胶作为食品添加剂的应用越来越广泛。通过水解黄原胶制备的黄原胶寡糖(XGOS)具有抗氧化、抗凋亡、益生等特殊生物活性,具有很高的附加值和广阔的应用前景。酶法水解黄原胶具有反应条件温和、过程可控等优点,但特异性酶较难获取,且黄原胶的大分子特性导致其酶解效率较低。针对以上问题,本研究将骆驼瘤胃元基因组来源的内切β-1,4-葡聚糖酶(Persi Cel4)在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中表达,并与野油菜黄单胞菌(*** CCTCC M2015714)建立耦合发酵体系一步法制备XGOS。最后对XGOS进行分离提取、结构表征及生物活性研究。主要研究成果如下:(1)通过异源表达骆驼瘤胃元基因组来源的Persi Cel4,构建了重组毕赤酵母GS115-p PIC9K-persi Cel4,随后对其发酵条件进行优化,并研究了Persi Cel4酶学性质。结果显示,重组毕赤酵母摇瓶水平的最佳发酵条件为p H 6.0、28℃、装液量20%、甲醇添加量1.5%,在7 L发酵罐中Persi Cel4活力达到17.97 U·m L。Persi Cel4的最适催化条件为p H 7.0、75℃,能直接水解商品黄原胶得到重均分子量为1536 Da的XGOS-1,其在水解产物中占比48.17%。此外,通过在野油菜黄单胞菌发酵过程中流加Persi Cel4酶液,建立了一种新型XGOS生产策略,最终获得重均分子量为1808 Da的XGOS-2,占水解产物的51.50%。(2)建立了重组毕赤酵母与野油菜黄单胞菌的耦合发酵体系,毕赤酵母分泌的Persi Cel4直接水解野油菜黄单胞菌生产的黄原胶来一步法制备XGOS。进一步对耦合发酵条件进行优化,最佳发酵条件为:野油菜黄单胞菌单独发酵36 h后,将4倍(v·v)接种量的毕赤酵母接入发酵体系,控制此阶段p H为7.0,每24 h添加发酵液体积0.75%的甲醇至发酵结束。摇瓶水平中耦合发酵体系的总糖最高为11.40 g·L,产物中重均分子量为2500 Da的XGOS-3占比93.79%;在7 L发酵罐中,耦合发酵体系的总糖最高达到17.85 g·L,其中低分子量黄原胶(52 030 Da)占96.64%。(3)对上述三种方法(常规水解、流加酶液和耦合发酵)制备得到的XGOS-1、XGOS-2和XGOS-3进行提取纯化,通过单糖组成分析、MALDI-TOF MS分析、FT-IR光谱及NMR光谱对其结构进行解析,确定了XGOS-1的聚合度为8和9,XGOS-2的聚合度为5和10,XGOS-3的聚合度为14。三种XGOS均具有较高的抗氧化活性,当XGOS-1浓度为5 g·L时,DPPH自由基清除率达到76.47%,当XGOS-3浓度为5 g·L时,羟自由基清除率达到89.74%。体外益生菌发酵实验表明XGOS可有效促进某些肠道益生菌的生长,并且生成有益肠道健康的短链脂肪酸和乳酸。

关键词：内切β-1,4-葡聚糖酶毕赤酵母耦合发酵黄原胶寡糖生物活性

内切β-1，4-葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达

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内切β-1，4-葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达

作者：高博东北农业大学

学位级别：硕士

纤维素作为地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,同时也是自然界中存在的最廉价、最丰富的可再生资源,具有丰富的研究价值和意义。内切β-1,4-葡聚糖酶是纤维素酶系中研究最为广泛,最为深入的一种酶,其作用于纤维素的非结晶区,随机... 详细信息

纤维素作为地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,同时也是自然界中存在的最廉价、最丰富的可再生资源,具有丰富的研究价值和意义。内切β-1,4-葡聚糖酶是纤维素酶系中研究最为广泛,最为深入的一种酶,其作用于纤维素的非结晶区,随机水解p-1,4-糖苷键,将长链的纤维素截断,从而形成纤维低聚糖。纤维低聚糖是功能性低聚糖,是双歧杆菌的增殖因子,降低血清中胆固醇和甘油三酯含量,促进矿物质如钙、镁、铁等的吸收,低热量值。但是,生产纤维低聚糖主要依靠纤维素经酸或酶水解、得到纤维低聚糖分离纯化困难及工艺复杂,导致纯度不高,成分复杂,影响着纤维低聚糖保健功能,因此,为获得高纯度的单一聚合度的纤维低聚糖,就要求单一组分,高纯度的内切葡聚糖酶。目前,生产内切葡聚糖酶主要依靠微生物发酵的方式,其微生物菌种大多为真菌,如木霉、青霉、曲霉以及腐质霉等,被广泛用于生产内切葡聚糖酶。但单一产生内切葡聚糖酶菌株产量低、成本高及稳定性不理想等因素仍制约着纤维低聚糖的生产和应用。因此,开展内切葡聚糖酶高产重组菌株及发酵工艺研究等工作是非常必要的。同时,内切葡聚糖酶被广泛应用于啤酒、饲料、造纸等工业中。本研究采用黑曲霉CICC2462作为受体菌,虽然黑曲霉自身能够分泌内切β-葡聚糖酶,但野生型菌株的表达量低,且同时含有外切型-p-葡聚糖酶、p-葡萄糖苷酶等组分,不能满足生产纤维低聚糖等特殊要求。本实验拟利用黑曲霉中高表达的糖化酶基因(glaA)位点的调控作用,实现内切p-1,4-葡聚糖酶在黑曲霉中的同源表达,为获得高产量、高纯度的内切β-1,4-葡聚糖酶奠定基础。主要研究结果如下：1.内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达载体的构建根据Genebank中黑曲霉内切葡聚糖酶基因序列设计引物,从黑曲霉CICC2462中扩增得到内切葡聚糖酶基因engl。针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因(glaA)位点,利用基因置换技术,构建黑曲霉表达载体pSZHG-eng1。2.黑曲霉农杆菌的转化及内切β-1,4-葡聚糖酶同源重组转化子的筛选利用冻融法将农杆菌转化黑曲霉表达载体pSZHG-eng1转化到农杆菌AGL1中,利用引物P1、P2,对转化子进行菌落PCR鉴定,得到2株阳性转化子。利用同源重组引物对鉴定出的2株阳性转化子进行PCR鉴定,结果2株阳性转化子均扩增出1701bp的目的条带,证明是同源重组转化子,pSZHG-eng1载体转化的同源重组率为100%。3.内切β-1,4-葡聚糖酶在重组菌株中表达分析在摇瓶发酵条件下,发酵液上清中的内切葡聚糖酶活力最高可达到272U·mL-1,是出发菌株的5.2倍。重组菌株最适pH为6.0,最适温度为60℃,温度稳定性好。将酶活达到最高值的重组内切葡聚糖酶发酵液上清进行SDS-PAGE检测,结果显示2株重组菌株均成功分泌表达,明显高于出发菌株。经ALPHAIMAGER SYSTEMS软件分析,2株重组菌株蛋白表达量为165～193μg·mL-1。结果表明,本研究实现了内切β-1,4-葡聚糖酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级内切葡聚糖酶的大规模工业化生产奠定了基础。

关键词：内切β-1,4-葡聚糖酶黑曲霉同源重组表达

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黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶学特性

应用与环境生物学报 2012年第1期18卷 70-74页

作者：许利霞徐荣赵焕玉杨红华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室武汉430079

采用DNS法研究了我国广泛分布的一种低等木食性白蚁——黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶活特性以了解其纤维素降解机制.结果表明,内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)这3种酶的最佳反应时间均为15 min,最佳底... 详细信息

采用DNS法研究了我国广泛分布的一种低等木食性白蚁——黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶活特性以了解其纤维素降解机制.结果表明,内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)这3种酶的最佳反应时间均为15 min,最佳底物浓度为1%,最适反应pH为5.6,最适反应温度为35℃.在最适反应条件下,EG、CBH和BG的活性分别达到71.3(±13.9)U/mg、5.8(±0.8)U/mg和4.1(±0.7)U/***在体外的热稳定性较差,在50℃及更高温度酶活很低或完全失活,但该酶对pH稳定性较好,在pH 3.2～8.0范围内酶活力变化不大.Native-PAGE电泳检测到该白蚁体内至少有8种不同的EG活性条带,肠道不同部位纤维素酶活性条带种类不同.这些研究表明,木食性白蚁降解纤维素是一个复杂的过程,需要多种纤维素酶的共同作用.

关键词：黑胸散白蚁纤维素酶内切β-1,4-葡聚糖酶纤维二糖水解酶 β-葡萄糖苷酶酶活 Native-PAGE

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家蝇纤维素酶的检测及酶活性与其发育的关系

应用与环境生物学报 2013年第3期19卷 444-448页

作者：胡蓉张姝吴建伟国果付萍贵阳医学院基础医学院贵阳550004

为了解家蝇能否降解利用纤维素,采用DNSA法检测家蝇幼虫纤维素酶活性及酶学特性;并进一步研究纤维素酶活性与家蝇发育的关系.结果显示,在生长发育的不同时期,家蝇都具有滤纸酶活性,活性范围为0.85(±0.035)IU mg-1至10.45(±0.050)IU mg... 详细信息

为了解家蝇能否降解利用纤维素,采用DNSA法检测家蝇幼虫纤维素酶活性及酶学特性;并进一步研究纤维素酶活性与家蝇发育的关系.结果显示,在生长发育的不同时期,家蝇都具有滤纸酶活性,活性范围为0.85(±0.035)IU mg-1至10.45(±0.050)IU mg-1;家蝇纤维素酶的组成包含3种酶,即β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)、内切β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4 glucanase,EG)和外切β-1,4-葡聚糖酶(Exo-β-1,4-glucanase,CBH).在pH 5.6的条件下,这3种酶的最适反应温度和时间分别为50℃和60 min,在体外具有较强的热稳定性,50℃放置1 h后仍可保持较强的酶活性.纤维素酶活性随着家蝇的发育逐渐增高(P4个发育阶段,均是CBH最高,BG最低.增加家蝇幼虫饲料中粗纤维的含量,3龄幼虫的纤维素酶活性明显提高(P0.05).研究表明家蝇具有完整的降解利用植物纤维素的酶系,其纤维素酶活水平与家蝇的发育密切相关.

关键词：纤维素酶 β-葡萄糖苷酶内切β-1,4-葡聚糖酶外切β-1,4-葡聚糖酶酶活性发育家蝇

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糖苷水解酶的异源表达及酶学性质研究

糖苷水解酶的异源表达及酶学性质研究

作者：冯丹山东大学

学位级别：硕士

糖苷水解酶在生物体以碳水化合物为基础的新陈代谢过程中发挥着重要作用,就目前已知有2500多种。自然界发现的糖苷水解酶通常都存在一些不足,如表达量少、稳定性不强、底物特异性差、催化能力弱等,这些与人类生产使用的需求相悖,因此对... 详细信息

糖苷水解酶在生物体以碳水化合物为基础的新陈代谢过程中发挥着重要作用,就目前已知有2500多种。自然界发现的糖苷水解酶通常都存在一些不足,如表达量少、稳定性不强、底物特异性差、催化能力弱等,这些与人类生产使用的需求相悖,因此对其进行有效改造显得尤为迫切。本论文围绕两种糖苷水解酶的异源表达及酶学特性展开研究,分别为内切β-1,4-葡聚糖酶（EC3.***.1.4）和内切菊粉酶（EC3.***.1.7）。内切β-1,4-葡聚糖酶Cel12A（又称EG3）属于糖苷水解酶GH12家族,其能够对纤维素骨架中的β-1,4糖苷键随机水解,产生纤维素低聚糖。本论文中选取了草酸青霉 1 14-2（Penicillium oxalicum 114-2）、里氏木霉 QM6a（Trchodderma reesei QM6a）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）来源的cel12A基因,使用毕赤酵母蛋白表达体系,对Cel12A蛋白异源表达成功。将表达成功的三种Cel12A蛋白,与里氏木霉发酵所得的Tlx1发酵液进行复配,以Avicel、DCCR、CCR为底物进行糖化实验,以分析Cel12A对高浓度底物的降解情况。分析发现Tlx1酶液中复配Cel12A蛋白,可以在一定程度上促进高浓度底物的降解,对后续Cel12A蛋白的应用有一定的指导意义,但仍需对其最优添加量及糖化条件进行优化。内切型菊粉酶是糖苷水解酶GH32家族中的一种酶,可以将菊芋中的菊粉催化水解为果糖或低聚果糖。由于低聚果糖具有多种保健功能,因此本实验选取黑曲霉（Aspergillus niger）来源的内切型菊粉酶基因,将其重组于里氏木霉T1ΔligD基因组中获得转化株。将转化株进行摇瓶产酶,获取酶液后以菊粉为底物进行糖化实验。实验发现,菊粉酶酶活与糖化效果不理想,分析可能由于本实验中,未将菊粉酶进行纯化,直接以改造株酶液进行糖化,酶液成分过于复杂,里氏木霉中本身所表达酶类阻碍了菊粉酶对菊粉的降解,也可能由于CBH Ⅱ为诱导型启动子,虽然菊粉酶有所表达,但表达量有限,进而导致糖化结果不理想,后续需要对转化株做进一步改造。

关键词：糖苷水解酶异源表达内切β-1,4-葡聚糖酶内切菊粉酶