霍乱毒素A亚单位基因的原核表达及单克隆抗体的制备

作     者：陈健 韦雨杏 解晓燕 朱召芹 万延民 徐建青 CHEN Jian;WEI Yu-xing;XIE Xiao-yan;ZHU Zhao-qin;WAN Yan-min;XU Jian-qing

作者机构：温州医科大学浙江温州325035 上海市公共卫生临床中心上海201508 复旦大学生物医学研究院上海200032 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2014年第27卷第6期

页      面：780-783,788页

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 100103[医学-病原生物学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

基　　金：国家自然基金青年项目(81302605 31200108) 

主　　题：霍乱毒素 原核细胞 基因表达 杂交瘤细胞 单克隆抗体 

摘      要：目的 原核表达并纯化霍乱毒素A亚单位（cholera toxin subunitA,CTA）基因,建立分泌CTA单克隆抗体的杂交瘤细胞系,并制备单克隆抗体。方法 构建原核表达质粒pET30a-CTA,转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）,IPTG诱导表达6 h,表达产物经12%SDS-PAGE分析后,用Ni2＋亲和层析柱纯化;将纯化的重组CTA蛋白免疫C57BL/6小鼠,运用杂交瘤细胞技术制备抗CTA的单抗,采用Western blot法及体外阻断实验检测抗CTA单抗的特异性及对CT毒性作用的体外阻断。结果 原核表达质粒pET30a-CTA经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;表达的重组CTA蛋白在相对分子质量25 000～35 000之间可见明显的目的蛋白条带,纯化后的重组CTA蛋白纯度达90%以上;获得1株可分泌抗CTA单抗的杂交瘤细胞株G6C3-D10,可与CTA蛋白特异性结合,在相对分子质量25 000～35 000之间可见明显的特异条带;杂交瘤培养上清中CTA特异性抗体滴度为54,与CT混合后,可明显抑制CT所诱导的细胞内环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）水平的升高（P〉0.01）。结论 原核表达并纯化了CTA基因,获得了能够分泌具有阻断CT毒性作用的单抗的细胞株,为CTA毒性作用和佐剂机制的进一步研究提供了参考。