TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导

作     者：周洲 李永丽 源春彦 曲良建 ZHOU Zhou;LI Yong-Li;YUAN Chun-Yan;QU Liang-Jian

作者机构：河南科技大学林学院河南洛阳471003 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所北京100091 

出 版 物：《昆虫学报》 (Acta Entomologica Sinica)

年 卷 期：2014年第57卷第12期

页      面：1361-1367页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(U1204324) 国家高技术研究发展计划("863"计划)项目(2012AA101503) 

主　　题：舞毒蛾 滞育激素 TAT穿膜肽 蛋白转导域 融合蛋白 跨膜运输 

摘      要：【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。