布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测

作     者：范金明 王发兴 张波 江玲 李蓓 FAN Jin-ming;WANG Fa-xing;ZHANG Bo;JIANG Ling;LI Bei

作者机构：湖北医药学院基础医学院微生物教研室十堰442000 湖北医药学院基础医学院第一临床学院十堰442000 

出 版 物：《中华地方病学杂志》 (Chinese Journal of Endemiology)

年 卷 期：2013年第32卷第3期

页      面：263-266页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(31070814) 教育部科学技术研究重点项目(210144) 湖北省卫生厅青年科技人才项目(QJX2010-24) 湖北医药学院学生科研项目(2009-42) 

主　　题：布鲁杆菌 IV型分泌系统 免疫原性 疫苗 

摘      要：目的检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性，寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标。方法采用双酶切的方法，将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上，将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，异丙基-13-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达。利用重组VirB9蛋白所携带的His标签，通过Ni—NAT层析，纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白．再通过十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测。用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BALB／c小鼠，并以磷酸盐缓冲液（PBS）为对照。在免疫4周后，鼠尾取血，血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测$19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度。在免疫后第35天，取小鼠脾脏，分离脾细胞，利用Elispot技术，检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子（干扰素-1，IFN-1）的脾细胞数，酶联斑点图像仪计数斑点，每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞，分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况。结果通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741bp克隆至pET32a载体上。SDS—PAGE显示，VirB9蛋白的相对分子质量约43×103，纯度超过97％；BCA法检测，蛋白浓度为1．6异／L。免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度〉1：800；对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性。免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体，抗体滴度均〉1：3200，对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在。酶联斑点图像分析显示，用VirB9蛋白体外刺激，免疫组小鼠5×10s个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-r，对照组仅有38个细胞。结论在布鲁杆菌感染过程中，Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9具有免疫原性．能够刺激小鼠产生体液免疫反应与细胞免疫反应。