人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞分化的实验研究

作     者：慕宁 王明元 林雨冬 高毅 MU Ning;WANG Ming-yuan;LIN Yu-dong;GAO Yi

作者机构：解放军福州总医院95临床部普外科福建省莆田351100 南方医科大学珠江医院普外科 

出 版 物：《中华肝脏病杂志》 (Chinese Journal of Hepatology)

年 卷 期：2007年第15卷第3期

页      面：174-178页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

基　　金：广东省“十五”重点科技攻关专项基金(2002A3020206) 

主　　题：肝细胞 共同培养 细胞分化 显微镜检查 共焦 人骨髓来源多能成体祖细胞 

摘      要：目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法（1）取健康成人志愿者适量骨髓采用CD45、糖化蛋白A（GlyA）免疫微磁珠负分选，纯化培养CD45^-、GlyA^-hMAPCs。（2）间接共培养：将分别接种于盖玻片上的传代hMAPCs和人肝细胞系L02（密度均为1×10^5／ml）按照各50％比例共置于直径10cm培养皿中，培养液共通，实现间接共培养。分别于第1、3、5、7天免疫细胞化学鉴定hMAPCs的Alb、AFP、细胞角蛋白18（CK18）、细胞角蛋白19（CK19）等肝细胞特征性表型表达变化情况，并设阳性对照（单独培养的L02细胞）和阴性对照（单独培养未经诱导的hMAPCs），计数阳性细胞比率。（3）直接共培养：将CFSE荧光（绿色）标记的hMAPCs与L02（密度均为1×10^4／ml）按照各50％比例混合后接种于激光共聚焦显微镜检查专用培养皿内，实现直接共培养。5d后用SABC-Cy3免疫荧光（红色）双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察hMAPCs表达Alb、AFP、CK18的情况。同样设阳性对照（单独培养的CFSE标记L02细胞）和阴性对照（单独培养的CFSE标记MAPCs）。镜下表达黄色荧光的细胞即是向肝细胞分化的MAPCs，为阳性细胞；单纯表达绿色荧光的细胞为未分化的MAPCs；单纯表达红色荧光的细胞为L02细胞。结果（1）间接共培养结果：AFP作为不成熟肝细胞的表型标志，在间接共培养第l天表现为强阳性表达，随后逐渐减弱，至第7天，AFP的阳性表达已经很少。而Alb在第l天有可疑阳性表达，第3天，Alb即出现较强的阳性表达，第5天，Alb的阳性表达就达到高峰，第7天，密集生长的细胞仍广泛的阳性表达Alb。第l、3天检测CK18均为阴性，至第5天CK18开始出现阳性表达，第7天CK18阳性表达较前增强。CK19在各时间点均为阴性着色。阳性对照细胞Alb及CK18有较强的阳性表达，AFP弱阳性表达，CK19阴性表达。阴性对照细胞均为阴性表达。（2）直接共培养结果：Alb和CK18检测时，较多细胞质内出现黄色荧光表达，而AFP阳性荧光表达则仅出现在极个别细胞质内，该结果与阳性对照细胞荧光表达类似，而阴性对照细胞未见有阳性荧光表达。结论（1）与人肝细胞系L02间接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。（2）与人肝细胞系L02直接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化，且时间有提前趋势。