应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

作     者：张玉哲 任善会 姚威 龚真莉 张红强 柳民意 尤婷 王相伟 李积雲 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 ZHANG Yuzhe;REN Shanhui;YAO Wei;GONG Zhenli;ZHANG Hongqiang;LIU Minyi;YOU Ting;WANG Xiangwei;LI Jiyun;YIN Xiangping;SUN Yuefeng;CHEN Haotai;WAN Xuerui

作者机构：甘肃农业大学兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046 重庆市万州区畜牧产业发展中心重庆400000 青海省科学技术信息研究所西宁810003 

出 版 物：《畜牧兽医学报》 (ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA)

年 卷 期：2024年第55卷第10期

页      面：4517-4529页

核心收录：

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家自然科学基金(32302850) 甘肃省科技计划资助(22JR5RA035) 甘肃省科技重大专项(22ZD6NA001) 中国农业科学院兰州兽医研究所基本科研业务费(1610312021008) 

主　　题：牛结节性皮肤病病毒 TK基因 Cre/LoxP系统 重组毒株 

摘      要：利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。