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稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 43-48页

作者：杨雪任善会王相伟龚真莉殷相平孙跃峰陈豪泰万学瑞甘肃农业大学动物医学院兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞... 详细信息

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

关键词：绵羊睾丸原代细胞人端粒酶逆转录酶基因 hTERT 永生化细胞系

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一株多谱系重组NADC34-like-PRRSV的分离鉴定及其基因组特征分析

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病毒学报 2024年

作者：张兴民张婧虞凌雪王健王方洲李娇阳李国秀李冬马雪青白兴文龚真莉卢曾军曾巧英孙普中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃农业大学中国农业科学研究院上海兽医研究所

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的仔猪肺脏组织和血清，经（Open Reading Frame 5,ORF5）基因分型RT-PCR扩增测序鉴定，阳性样品进行病毒分离。经间接免... 详细信息

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的仔猪肺脏组织和血清，经（Open Reading Frame 5,ORF5）基因分型RT-PCR扩增测序鉴定，阳性样品进行病毒分离。经间接免疫荧光试验和感染细胞病理电镜切片鉴定分离毒株，采用RT-PCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增，利用生物学软件分析其遗传演化特征，同时也对该场107份猪血清样本检测。研究结果显示，ORF5基因分型RT-PCR扩增测序结果表明，该猪场为NADC34-like-PRRSV感染；间接免疫荧光显示能够与PRRSV N蛋白单克隆抗体（SR30）反应，电镜观察到感染细胞中直径大小为50-80 nm病毒粒子，其基因组全长大小为15078 bp，将分离株命名为PRRSV GSJT/9/2021株。分离株与不同谱系代表株VR-2332、JXA1、HuN4、NADC30和NADC34的全长核苷酸序列同源性分别为85.2%、86.4%、86.5%、88.7%和85.9%;ORF5基因序列与代表毒株ORF5基因序列及编码氨基酸序列的相似性分别为83.7%～94.9%与84.6%～95.5%，其中与IA/2014/NADC34毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高分别为94.9%和95.5%；基于GSJT/9/2021全基因组和ORF5基因分别构建进化树对分离株进行分型，结果显示GSJT/9/2021的全基因组与类NADC30毒株亲缘关系较近，属于同一个分支，而ORF5基因遗传进化树表明GSJT/9/2021毒株与类NADC34毒株亲缘关系最近；ORF5氨基酸序列分析结果显示，ORF5的变异程度最大，GP5蛋白中4个糖基化位点与国内流行的NADC34毒株相比额外增加一个糖基化位点第57位，在诱骗表位37-45 aa中第38、39位出现独特突变（H38Q,L39F）;Nsp2氨基酸序列分析结果显示，Nsp2蛋白存在“111+1+19a”(323-433位、483位、504-522位)缺失模式，与NADC30毒株缺失模式一致；重组分析表明GSJT/9/2021株由NADC30-like PRRSV、HUN4与IA/2014/NADC34之间发生重组变异而来，重组位点分别位于Nsp4、Nsp9、GP2a和M的氨基端。107份血清的PRRSV N蛋白抗体阳性率达98.2%。综上，PRRSV GSJT/9/2021株是1株多谱系重组变异NADC34-like-PRRSV，通过深入解析重组毒株的遗传变异和生长特性，为甘肃地区防控PRRS具有重要的指导意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒多谱系重组毒株分离鉴定基因组特征细胞嗜性

靶向山羊痘病毒GPCR基因SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年

作者：张红强任善会姚威龚真莉杨雪马春玲尤婷张玉哲柳民意钱文洁李柳杨余志鹏孙跃峰陈豪泰樊江峰甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所重庆市万州区畜牧产业发展中心

基于山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）的基因组序列，建立靶向G蛋白偶联趋化因子受体（G-protein-coupled chemokine receptor，GPCR）基因的荧光定量PCR检测方法。基于GTPV全基因序列设计了六对qPCR引物，并进行特异性和灵敏性的... 详细信息

基于山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）的基因组序列，建立靶向G蛋白偶联趋化因子受体（G-protein-coupled chemokine receptor，GPCR）基因的荧光定量PCR检测方法。基于GTPV全基因序列设计了六对qPCR引物，并进行特异性和灵敏性的筛选和检测，最终筛选得到一对高特异性和灵敏性的荧光定量PCR引物；根据GTPV/AV41疫苗株GPCR基因序列，设计普通PCR引物，扩增GPCR基因，构建真核表达载体，建立荧光定量PCR标准曲线。结果：筛选得到一对靶向于GPCR基因的特异性qPCR引物；构建了pCAGGS-GPCR真核表达质粒，建立了标准曲线Y= -3.5289x+49.07，线性相关系数R2=0.997 2，扩增效率为92.7%；验证性实验结果显示该引物最低检测限为2.0拷贝数·μL-1，各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%，表明其具有特异性强、重复性好和灵敏度高的优点。建立了靶向山羊痘病毒GPCR基因的qPCR检测方法。为防控山羊痘提供了高效的检测手段。

关键词：山羊痘病毒 GPCR 荧光定量PCR

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2-E^(rns)融合蛋白及免疫原性分析

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中国兽医科学 2023年第10期53卷 1207-1215页

作者：李亚军郝荣增茹毅龚真莉刘艳红郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在利用CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2-E^(rns)融合蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建融合表达BVDV E2和E^(rns)蛋白的真核重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2-... 详细信息

本研究旨在利用CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2-E^(rns)融合蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建融合表达BVDV E2和E^(rns)蛋白的真核重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2-E^(rns),转染CHO细胞,进行上清分泌表达;离心收集细胞培养上清进行亲和层析纯化,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定纯化蛋白的免疫反应性;使用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,通过细胞免疫荧光(IFA)试验和间接ELISA试验鉴定E2-E^(rns)融合蛋白免疫家兔血清的抗体反应性和抗体效价。结果,通过CHO细胞表达系统,成功制备了纯化的BVDV E2-E^(rns)融合蛋白,Western-blot鉴定结果显示,His标签单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的融合蛋白发生特异性免疫反应。间接ELISA和IFA试验结果显示,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平可达1∶512000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV发生特异性免疫反应。上述结果表明,本研究成功利用CHO细胞表达系统制备并纯化了BVDV E2-E^(rns)融合蛋白,并通过体内和体外试验证明该融合蛋白具有良好的免疫原性,为BVD的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。

关键词：牛病毒行腹泻病毒 E2-E^(rns)融合蛋白真核表达 CHO培养免疫原性

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)蛋白的中华仓鼠卵巢细胞表达及免疫原性分析

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4861-4873页

作者：李亚军茹毅郝荣增秦晓东卢炳州杨洋刘华南张越龚真莉刘艳红余四九郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E^(rns)蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^(rns)蛋白重组真核表达质粒... 详细信息

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E^(rns)蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^(rns)蛋白重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E^(rns),转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达。SDS-PAGE分析E^(rns)蛋白的表达和纯化,并用抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清进行Western blotting鉴定纯化蛋白;进一步使用纯化的E^(rns)蛋白免疫新西兰大白兔,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)实验检测血清抗体水平及其免疫反应活性,用病毒中和实验测定免疫兔血清的中和抗体滴度。BCA蛋白定量试剂盒检测纯化的E^(rns)蛋白浓度为0.886 mg/m L,Western blotting结果显示,抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的E^(rns)蛋白发生特异性免疫反应。间接ELISA和IFA实验结果显示,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平可达1:128000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV病毒发生特异性免疫反应。重组E^(rns)蛋白免疫兔可诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为log10=2.71。本研究利用CHO细胞表达系统成功制备了纯化的BVDV E^(rns)蛋白,并通过体内和体外实验证明,该重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)诊断方法及新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E^(rns)蛋白真核表达中华仓鼠卵巢(CHO)细胞悬浮培养免疫原性

CHO细胞表达重组猪干扰素-γ及其抗病毒活性

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4784-4795页

作者：王凌云郝荣增杨洋李亚军卢炳州毛玉涵张越龚真莉刘艳红齐萌茹毅郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒pc DNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用。结果显示,本研究利用CHO悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15系统检测其活性效价为5.59×10^(7) U/mg;此外,rPoIFN-γ可诱导细胞内多种ISGs和细胞因子的表达,并显著抑制SVA的复制。总之,本研究成功利用CHO表达系统制备了高活性的rPoIFN-γ,并在体外完成其对SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础。

关键词：猪干扰素-γ 塞内卡病毒A 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白表达与纯化抗病毒活性

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微小牛蜱唾液腺cDNA文库的构建

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第5期26卷 389-391页

作者：田占成刘光远谢俊仁龚真莉中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cDNA表达文库。经测定,文库... 详细信息

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cDNA表达文库。经测定,文库的库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU/ml。用兔抗微小牛蜱唾液腺蛋白阳性血清,对文库进行初步免疫学筛选,获得一个细胞色素氧化酶第2亚基cDNA序列。将该基因序列与GenBank中的序列进行同源性比对,发现与已知的其他物种细胞色素氧化酶第2亚基的氨基酸序列同源性为60%～77%。微小牛蜱唾液腺cDNA表达文库构建成功。

关键词：微小牛蜱唾液腺 cDNA文库构建

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

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畜牧兽医学报 2021年第1期52卷 256-261页

作者：李鹏飞龚真莉杜晓华蒋韬甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_v... 详细信息

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β_6亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M~(-1)s~(-1)、3.1×10~(-4)s~(-1)和7.33×10~(-6)M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M~(-1)s~(-1)、2.13×10~(-4)s~(-1)和9.79×10~(-5)M;与β_6亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。

关键词： Biacore 3000 FMDV RGD基序表面等离子体共振整联蛋白动力学

基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

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中国兽医学报 2009年第9期29卷 1140-1143页

作者：刘光远田占成龚真莉谢俊仁李知新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

利用18S rRNA基因序列分析方法，对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究。用分离的锥虫感染实验动物，自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA，根据GenBank中已发表的锥虫18S rRNA序列设计1对... 详细信息

利用18S rRNA基因序列分析方法，对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究。用分离的锥虫感染实验动物，自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA，根据GenBank中已发表的锥虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物，通过PCR扩增目的基因片段，将扩增产物连接到pGEM—T载体中，经酶切、PCR确定．进行序列测定。结果显示，7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2188bp。利用DNAStar对试验所获得的这7株堆虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析，建立2个进化系统发生树。核苷酸同源性比较及系统发生树显示：自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系，布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异，与国外的6株锥虫的同源性为99％～100％。与另外7株的同源性为62％。

关键词：锥虫 18S rRNA基因分子分类学