奶牛乳源外泌体提取方法的优化及效果评价

作     者：赵莹 王靖雷 王萌 王立斌 张倩 李志杰 马鑫 余四九 潘阳阳 ZHAO Ying;WANG Jinglei;WANG Meng;WANG Libin;ZHANG Qian;LI Zhijie;MA Xin;YU Sijiu;PAN Yangyang

作者机构：甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070 

出 版 物：《动物营养学报》 (CHINESE JOURNAL OF ANIMAL NUTRITION)

年 卷 期：2024年第36卷第2期

页      面：1265-1276页

核心收录：

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：甘肃农业大学青年导师基金(GAU-QDFC-2022-02) 甘肃省重点人才项目(2022RCXM016) 国家自然科学基金地区项目(32160859) 甘肃省杰出青年基金(20JR10RA561) 

主　　题：乳源外泌体 差速超速离心法 乙酸 凝乳酶 提取鉴定 

摘      要：乳源外泌体在疾病治疗及载体效应等领域应用颇为广泛,但目前乳源外泌体的提取方法仍步骤繁琐,耗时长,难以推广应用。为建立省时、高效和稳定的乳源外泌体提取方法,本试验在前期已建立的差速超速离心法、凝乳酶法、乙酸法及蔗糖密度梯度离心法的基础上,通过增加离心速度、改变乙酸或凝乳酶用量、调整蔗糖密度梯度、减少离心步骤进行逐一优化。通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析、蛋白浓度检测、免疫印迹鉴定比较乳源外泌体形态结构、粒径大小、蛋白浓度、粒子浓度、特异性标记蛋白的差异,筛选出最优提取方法。结果显示:4种优化后提取方法均可分离获得具有典型“茶托形状,介于30~200 nm的细胞外囊泡,但优化后的乙酸法提取乳源外泌体最多,视野密度高达80%以上,粒径大小为(151.0±47.2)nm,粒子浓度为6.2×10^(12)个/mL,均高于其他优化方法;优化后的乙酸法提取乳源外泌体的特异性标记蛋白[肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克蛋白70(HSP70)、CD81和CD9]均表达量较高,其他3种优化方法提取到的乳源外泌体特异性标记蛋白发生不同程度降解,且提取乳源外泌体所得样品蛋白浓度均显著高于优化的乙酸法(P0.05)。结果表明,优化后奶牛乳源外泌体乙酸提取法具有方法简单、耗时短、纯度高、特异性标记蛋白稳定等优点,该方法为外泌体需求量大的试验、医疗、工业生产等奠定一定基础。