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瘦素及其受体在牦牛附睾的时空表达特性

农业生物技术学报 2024年第2期32卷 334-343页

作者：王晓艳崔燕余四九马睿何俊峰张虔龙敏甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

瘦素(leptin)及瘦素受体(leptin receptor, LEPR)在雄性动物生殖调控中发挥重要作用。为探究Leptin及LEPR在性成熟前后牦牛(Bos grunniens)附睾头、体、尾中的分布特点及表达动态，本研究采集性成熟前(幼年)及性成熟后(成年,老年)牦牛... 详细信息

瘦素(leptin)及瘦素受体(leptin receptor, LEPR)在雄性动物生殖调控中发挥重要作用。为探究Leptin及LEPR在性成熟前后牦牛(Bos grunniens)附睾头、体、尾中的分布特点及表达动态，本研究采集性成熟前(幼年)及性成熟后(成年,老年)牦牛附睾不同部位(头,体,尾)，利用qPCR、Western blot和免疫组织化学染色方法检测Leptin及LEPR在不同年龄牦牛附睾头、体、尾中的分布及表达水平。免疫组化结果显示，Leptin和LEPR主要表达在附睾上皮、基底细胞和平滑肌细胞，其中附睾上皮呈强阳性表达；q PCR结果显示，Leptin及LEPR在幼年牦牛附睾头、体和尾的基因表达量显著高于成年和老年(P0.05);Western blot结果显示，Leptin及LEPR蛋白在不同年龄牦牛附睾中均有表达，其表达量在幼年组最高，从幼年、成年及老年，依次呈递减趋势，且各年龄之间差异显著(P0.05);Leptin及LEPR蛋白在成年和老年附睾中的表达量为附睾尾>附睾头>附睾体，且各部位之间差异显著(P研究为探究高原环境下雄性牦牛的生殖调控机制提供研究资料。

关键词：牦牛附睾瘦素(leptin) 瘦素受体(LEPR)

Hippo信号通路下游关键因子YAP和TEAD-1在牦牛胎盘发育中的表达与定位

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农业生物技术学报 2024年第6期32卷 1342-1352页

作者：钱文洁杜培岩李一娟周应聪姚颖李柳杨余志鹏柳民意张红强崔燕余四九樊江峰甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)和TEA转录因子1 (TEA domain transcription factor 1,TEAD-1)是Hippo信号通路的核心因子，在调控细胞增殖和器官生长方面发挥重要作用。为检测YAP和TEAD-1在牦牛(Bos grunniens)胎盘不同发育时期的表达，探究Hippo信号通路在调控胎盘生长发育方面的生理作用，本研究采集妊娠牦牛胎盘组织样品，以胎儿头臀距为依据，将其分为不同发育阶段(5月龄)，采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术对YAP和TEAD-1的表达情况进行了检测分析。结果显示，在牦牛胎盘组织中，YAP和TEAD-1主要表达于胎儿绒毛膜滋养巨细胞、柱状滋养细胞和母体子宫肉阜隐窝上皮细胞。随着妊娠的进行，YAP和TEAD-1mRNA及其蛋白在牦牛胎盘组织中的表达量有明显的变化，且YAP和TEAD-1的变化趋势基本一致。这种协同表达特性及其表达量与胎盘发育阶段的相关性，提示YAP和TEAD-1可能通过Hippo信号通路参与了牦牛胎盘发育的调控，并在胎盘组织生理功能的发挥和妊娠维持方面发挥重要作用。研究结果为阐明牦牛胎盘发育及妊娠调控机制提供理论依据。

关键词：牦牛胎盘 Yes相关蛋白(YAP) TEA转录因子1 (TEAD-1)

地西泮结合抑制剂在牦牛不同大小卵泡中的表达与定位

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第8期52卷 11-17页

作者：王立斌王强龙潘阳阳黄振华赵天丁天翊刘敏清崔燕余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

【目的】研究地西泮结合抑制剂(diazepam binding inhibitor, DBI)在牦牛不同大小卵泡中的表达水平与定位,探讨DBI蛋白在牦牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采集牦牛卵巢组织,分离不同大小(直径8 mm)的卵泡。采用实时荧光定量方法(... 详细信息

【目的】研究地西泮结合抑制剂(diazepam binding inhibitor, DBI)在牦牛不同大小卵泡中的表达水平与定位,探讨DBI蛋白在牦牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采集牦牛卵巢组织,分离不同大小(直径8 mm)的卵泡。采用实时荧光定量方法(qRT-PCR)检测DBI基因mRNA在牦牛不同大小卵泡中的相对表达量,并利用蛋白免疫印迹技术(Western-blotting, WB)检测DBI蛋白的表达情况。采用免疫组织化学方法(immunohisto chemistry, IHC)定位DBI蛋白在雌性牦牛完整成熟卵泡中的分布情况。采用免疫荧光技术(immunofluorescence, IF)检测DBI在牦牛卵母细胞中的定位。【结果】DBI基因mRNA和DBI蛋白在牦牛不同大小卵泡中均表达,但表达水平存在显著差异(P<0.05),表达量随着牦牛卵泡直径的增大而显著上升。DBI蛋白在牦牛成熟卵泡中的颗粒细胞、卵丘细胞均有分布;在卵母细胞中主要定位于细胞质、细胞核。【结论】DBI在类固醇激素合成与卵母细胞成熟过程中具有重要作用。

关键词：牦牛地西泮结合抑制剂卵泡发育卵母细胞表达与定位

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞中自噬相关因子表达的调控

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中国兽医科学 2024年

作者：卢鸿琴崔燕白雪峰卢增华谢夏婷甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

本研究旨在探究长期高海拔低氧环境对牦牛肾小管上皮细胞（RTECs）中自噬相关因子表达的影响。通过应用免疫组织化学、免疫荧光、qRT-PCR、Western-blot试验，比较了成年牦牛和黄牛肾脏中HIF-1α的分布和表达情况。免疫组织化学和免疫... 详细信息

本研究旨在探究长期高海拔低氧环境对牦牛肾小管上皮细胞（RTECs）中自噬相关因子表达的影响。通过应用免疫组织化学、免疫荧光、qRT-PCR、Western-blot试验，比较了成年牦牛和黄牛肾脏中HIF-1α的分布和表达情况。免疫组织化学和免疫荧光染色结果显示，HIF-1α在成年牦牛和黄牛肾脏组织中均呈阳性表达，主要分布在肾小管，集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞中。WB和qRT-PCR结果表明，成年牦牛肾脏中HIF-1α的表达显著高于黄牛（P研究了HIF-1α药物抑制和过表达对自噬相关因子表达作用。使用药物DMOG诱导RTECs中的HIF-1α的表达上调时，BNIP3、Beclin-1蛋白和mRNA的表达量升高（P研究结果表明HIF-1α是调控牦牛肾脏中自噬相关因子表达的重要基因。

关键词：牦牛低氧诱导因子-1α(HIF-1α) 肾小管上皮细胞(RTECs) 自噬

促红细胞生成素对牦牛肾间质成纤维细胞凋亡因子表达的影响

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3460-3471页

作者：卢增华崔燕余四九白雪峰卢鸿琴何俊峰卢凯翟国亮祁正满甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛R... 详细信息

旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛RIFs进行原代培养鉴定,并对其进行不同药物处理来调控RIFs中EPO表达水平,检测EPO对凋亡相关基因Bax,Bcl-2,PCNA在mRNA和蛋白表达水平的影响。免疫组化学检测结果显示,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达。qRT-PCR和Western blot结果显示,EPO在牦牛肾脏中的表达量显著高于黄牛(P<0.001)。随后对生成EPO的RIFs进行原代培养并调控EPO的表达,结果表明:激活组显著升高RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,降低Bax的表达(P<0.001)。EPO抑制组显著降低RIFs中Bcl-2、PCNA的表达,上调Bax的表达(P<0.001)。综上表明,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达,牦牛肾脏中的EPO高表达能够促进RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,并降低Bax的表达,说明EPO可以在牦牛肾脏中起到抗凋亡的作用。

关键词：牦牛促红细胞生成素(EPO) 肾间质成纤维细胞(RIFs) 凋亡

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基于TMT技术的牦牛妊娠期血清蛋白质组学分析

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 192-206页

作者：姚颖周应聪杜培岩李一娟钱文洁李柳杨余志鹏崔燕余四九樊江峰甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对... 详细信息

为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对授配母牦牛进行妊娠诊断。依据诊断结果将采集的样品进行回顾性分组,即妊娠第1、2、3月组及未妊娠组(未妊娠组样品来自AI后90天经妊娠诊断确诊为未孕的牦牛个体),每组样品3个生物学重复。利用串联质谱标签(TMT)技术对牦牛血清样品的蛋白表达情况进行定量分析,筛选差异表达蛋白,并对其进行GO功能富集和KEGG通路等生物信息学分析,进一步筛选与牦牛妊娠维持相关的潜在蛋白。结果显示,在4组牦牛血清蛋白样品中共获得497个蛋白,以差异倍数≥1.2或≤0.83,且P研究结果表明,牦牛妊娠早期存在明显的血清蛋白组的变化。这些DEPs分别在促进细胞粘附与增殖、母胎血管生成、维持母体代谢与免疫平衡等过程中起到重要作用。尤其是IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1可能通过参与调节胎盘生长发育、免疫应答和脂质代谢等过程,在牦牛妊娠维持中发挥着重要作用。研究结果为进一步探明牦牛维持妊娠过程的调控机制提供了基础资料。

关键词： TMT 蛋白质组学牦牛血清差异表达蛋白妊娠维持

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牦牛HMGN1多克隆抗体制备及应用

核农学报 2024年第11期38卷 2106-2115页

作者：李玉平王立斌潘阳阳王萌张晖张瑞贾利毅余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

为了克隆牦牛高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)基因并制备牦牛HMGN1多克隆抗体,探究HMGN1在牦牛生殖生理研究过程中的作用,本研究通过基因克隆获得牦牛HMGN1基因序列并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HMGN1... 详细信息

为了克隆牦牛高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)基因并制备牦牛HMGN1多克隆抗体,探究HMGN1在牦牛生殖生理研究过程中的作用,本研究通过基因克隆获得牦牛HMGN1基因序列并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HMGN1在牦牛子宫、卵巢、输卵管中的相对表达量。利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛HMGN1重组蛋白,免疫10月龄新西兰大白兔,亲和层析法纯化所制备的牦牛HMGN1多克隆抗体;分别利用蛋白免疫印迹(WB)、免疫组织化学技术(IHC)检测HMGN1在牦牛生殖器官中的表达和定位;利用免疫荧光技术(IF)检测HMGN1蛋白在颗粒细胞中的表达。本试验成功克隆了牦牛HMGN1基因并制备了牦牛HMGN1多克隆抗体。WB结果显示,HMGN1蛋白在黄体期和卵泡期牦牛子宫的表达量高,妊娠期的表达量最低(P研究结果为进一步研究HMGN1蛋白在调节牦牛生殖生理机制提供了基础资料。

关键词：牦牛 HMGN1 原核表达多克隆抗体

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MST1和LATS1在牦牛黄体形成、维持和退化中的表达及HCG对其表达的影响

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农业生物技术学报 2024年第8期32卷 1844-1856页

作者：周应聪张同享王靖雷赵凌张瑞姚颖钱文洁崔燕余四九樊江峰阿拉善左旗动物疫病预防控制中心甘肃农业大学动物医学院甘肃农业大学甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

哺乳动物STe20样激酶1 (mammalian STE20-like kinase 1, MST1)和大肿瘤抑制蛋白1 (large tumor suppressor kinase 1, LATS1)是Hippo通路核心激酶级联反应链的关键成员，参与雌性动物生殖过程并发挥重要作用。为探究MST1和LATS1与牦牛(... 详细信息

哺乳动物STe20样激酶1 (mammalian STE20-like kinase 1, MST1)和大肿瘤抑制蛋白1 (large tumor suppressor kinase 1, LATS1)是Hippo通路核心激酶级联反应链的关键成员，参与雌性动物生殖过程并发挥重要作用。为探究MST1和LATS1与牦牛(Bos grunniens)黄体(corpus luteum, CL)形成、维持和退化之间的关系。本研究采集雌性牦牛黄体组织，按照黄体形成(红体期和有腔黄体期)、维持(妊娠黄体期)和退化(退化黄体期)的不同阶段将材料分为4组，通过qPCR和Western blot检测MST1和LATS1 mRNA及蛋白在黄体形成、维持和退化中的表达差异性，运用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)对MST1和LATS1在黄体形成、维持和退化中进行定位分析。另外，分离培养牦牛卵巢颗粒细胞(granule cells,GC)，通过添加人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)诱导颗粒细胞黄体化，采用qPCR、Western blot和免疫荧光(immunofluorescence, IF)等方法对MST1和LATS1 m RNA及蛋白在颗粒细胞黄体化前后进行定量和定位分析。结果显示，MST1和LATS1 mRNA及蛋白在牦牛黄体不同发育阶段表达量存在差异，在妊娠黄体期MST1表达量最高，而LATS1在有腔黄体期的表达最为丰富，在退化黄体期MST1和LATS1表达量均最低。IHC结果显示，在牦牛粒性黄体细胞中MST1和LATS1分布广泛，且MST1在血管内皮细胞中特征表达。添加5 IU/mL HCG诱导颗粒细胞黄体化后，MST1和LATS1 m RNA及蛋白的表达量极显著上升。通过IF染色发现，MST1和LATS1蛋白主要定位于颗粒细胞细胞质，且黄体化前后位置没有改变。研究结果表明，MST1和LATS1介导Hippo信号通路通过控制颗粒细胞分化，黄体细胞增殖和凋亡，参与雌性牦牛黄体组织的形成、维持、退化以及功能运转，并且与黄体生理过程中各类生殖激素密切相关。本研究为进一步探索Hippo信号通路对牦牛黄体组织大小调控以及调节哺乳动物生殖生理过程的作用机制提供了基础资料。

关键词：牦牛黄体哺乳动物STe20样激酶1 (MST1) 大肿瘤抑制蛋白1 (LATS1) Hippo通路 HCG

抑制Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟过程中引起线粒体功能障碍和整合应激反应

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中国畜牧杂志 2024年第6期60卷 213-221页

作者：李晗星夏威陶晨雨房晓欢齐雅天周振民李俊杰河北农业大学动物科技学院河北保定071000 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心河北保定071000

本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母... 详细信息

本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母细胞体外培养16 h后,通过免疫荧光染色检测纺锤体形态、ROS水平、线粒体分布和质量,利用qPCR检测抗氧化基因表达、线粒体呼吸链亚基的表达、整合应激反应相关基因的表达。结果表明:与对照组相比,130μmol/L Mic60抑制剂会降低卵母细胞体外成熟率(78.29%vs.21.08%,P<0.01),并显著阻碍纺锤体的组装;与对照组相比,Miclxin组卵母细胞中的ROS水平升高(P<0.05),且Sod1(0.83 vs. 0.22)和Sod2(0.84 vs. 0.27)基因表达降低(P<0.05),线粒体分布异常比例升高(0.16 vs. 0.57,P<0.05),线粒体膜电位水平降低(1.61 vs. 1.05,P<0.05),ATP产生降低(1.16 vs. 0.79,P<0.05);Miclxin组卵母细胞线粒体呼吸链复合体亚基Ndufv2和Sdha表达降低(P<0.05),Cyc1表达升高(P<0.05),卵母细胞mtDNA拷贝数降低(19 324 vs. 9 066,P<0.05);与对照组相比,Miclxin组卵母细胞Oma1、Dele1、Eif2ak1、eIF2α基因表达上调(P<0.05),触发了整合应激反应(Integrated Stress Response,ISR)并上调了ISR主要效应因子Atf4、Atf5和Chop的表达(P<0.05)。可见,抑制Mic60会通过损害线粒体功能并触发ISR影响卵母细胞体外成熟效果。

关键词：卵母细胞体外成熟 Mic60 线粒体功能整合应激反应小鼠

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