去氢骆驼蓬碱诱发PC12细胞凋亡时对线粒体融合分裂的影响

作     者：巩月红 赵美玲 马瑞佳 林玉霞 赵军 王建华 GONG Yuehong;ZHAO Meiling;MA Ruijia;LIN Yuxia;ZHAO Jun;WANG Jianhua

作者机构：新疆医科大学第一附属医院药学部乌鲁木齐830054 新疆医科大学药学院乌鲁木齐830054 新疆医科大学第七附属医院药学部乌鲁木齐830028 

出 版 物：《医药导报》 (Herald of Medicine)

年 卷 期：2024年第43卷第2期

页      面：174-183页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

基　　金：新疆维吾尔自治区科学技术厅自然科学基金面上项目(2020D01C240) 新疆维吾尔自治区科学技术厅自然科学基金重点项目(2021D01D15) 省部共建国家重点实验室开放课题(SKL-HIDCA-2022-9) 

主　　题：去氢骆驼蓬碱 PC12细胞 线粒体融合分裂 线粒体功能损伤 神经毒性损伤 

摘      要：目的探讨去氢骆驼蓬碱(HM)对PC12细胞线粒体功能损伤和线粒体融合分裂相关蛋白表达水平的影响。方法PC12细胞分为细胞对照组、HM组、线粒体分裂抑制剂Mdivi-1组、HM+Mdivi-1组、线粒体裂变激动剂WY14643组、HM+WY14643组,药物浓度均为1、10、25、50、100μmol·L^(-1),处理24 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,显微镜观察细胞形态;MitoTracker Red探针染色观察线粒体形态和纵横轴长度比值,JC-1染色检测线粒体膜电位,试剂盒检测ROS、ATP水平和乳酸脱氢酶(LDH)活性,免疫荧光染色法和Western blotting检测胱天蛋白酶3(caspase-3)、促凋亡蛋白(Bax)、细胞色素C(cyt-c)和线粒体融合蛋白(Mfn2)、线粒体分裂蛋白(Drp-1)的表达水平;电穿孔法转染Drp1的干扰序列,筛选转染效果好的siRNA序列,协同药物干预,通过荧光法、MTT法、免疫印迹法检测相关指标。结果MTT结果显示,与细胞对照组比较,HM组、Mdivi-1组、HM+Mdivi-1组、WY14643组和HM+WY14643组存活率显著下降(P0.01),EC 50分别为(11.48±2.32)、(12.35±1.67)、(14.88±2.07)、(39.14±3.25)、(20.09±1.97)μmol·L^(-1),依此后续实验选择20μmol·L^(-1)浓度的HM、Mdivi-1和HM+Mdivi-1作为构建PC12细胞模型的工作浓度;显微镜和MitoTracker Red探针染色观察发现,药物组细胞密度呈不同程度减少,树枝状突起减少变圆;线粒体形态趋向圆形,纵横轴长度比值分别为细胞对照组(3.33±0.72)、HM组(2.19±0.58)、Mdivi-1组(2.45±0.44)、HM+Mdivi-1组(1.43±0.62)。JC-1染色检测结果显示,与细胞对照组相比,HM组线粒体模电位显著下降(P0.01);ROS显著升高(P0.01)、ATP水平下降(P0.01),LDH酶活性上升(P0.01);免疫荧光染色法和Western blotting结果显示,与细胞对照组比较,HM组促凋亡蛋白Bax、细胞色素C、胱天蛋白酶3表达水平均显著上升(均P0.01);与细胞对照组比较,HM组细胞线粒体分裂相关蛋白Drp1表达水平显著上升(P0.01),而线粒体融合相关蛋白Mfn2的表达水平显著下降(P0.01);特异性干扰Drp1并协同HM干预后,各干扰组较各单独药物干预组PC12细胞存活率下降,Drp1和Mfn2表达下调,均差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论HM可通过ROS累积降低PC12细胞膜电位及ATP,进而激活caspase-3凋亡途径促使细胞凋亡,线粒体融合分裂可能参与HM造成PC12细胞的损伤,启动细胞线粒体途径凋亡。