植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产γ-氨基丁酸

作     者：肖杰文 韩瑾 乔郅钠 张国栋 黄武军 钱凯 徐美娟 张显 杨套伟 饶志明 XIAO Jiewen;HAN Jin;QIAO Zhina;ZHANG Guodong;HUANG Wujun;QIAN Kai;XU Meijuan;ZHANG Xian;YANG Taowei;RAO Zhiming

作者机构：江南大学生物工程学院江苏无锡214122 仁仁健康产业有限公司江西宜春331200 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2023年第39卷第6期

页      面：2108-2125页

核心收录：

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFC2100900) 国家自然科学基金(32071470) 

主　　题：γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶 pH改造 表面电荷 全细胞转化 

摘      要：氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGADS24R/D88R/Y309K在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃,菌体量OD600=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。