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分子改造甲烷八叠球菌醇脱氢酶催化合成4-羟基-2-丁酮

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应用与环境生物学报 2024年

作者：张笛张恒维张迪杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍... 详细信息

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍生物。首先克隆表征了一种甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)来源的醇脱氢酶(MeADH)，研究发现，其可用于催化1，3-BDO合成4H2B。MeADH最适催化温度为60 ℃，最适催化pH为10.0。经酶学性质分析发现，MeADH在最适反应温度60 ℃下孵育48 h仅剩7.51%左右残余酶活力，说明其热稳定性不佳。基于计算机辅助设计选择了15个突变位点，筛选得到一个双突变MeADHE246P/T296P，在60 ℃条件下孵育48 h，其残余酶活为初始酶活的40.27%左右，比原始酶提高了5.36倍。此外，MeADH催化反应过程中需要辅酶NADP+，本文通过引入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)来源的NADH氧化酶(LrNox)突变体LrNoxL179S构建了NADP+辅酶循环体系，并将其应用到4H2B的生物合成中。通过优化反应条件和底物流加实验，4H2B合成量最高达到2.2 g/L左右，为后续进行高效生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物的研究奠定了基础。(图10 表3 参29)

关键词： 4-羟基-2-丁酮醇脱氢酶辅酶循环再生热稳定性

基于两相交开口谐振环的超材料太赫兹带阻滤波器

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光学学报 2024年第5期44卷 112-119页

作者：袁航付旺廷刘祖耀饶志明骆兴芳朱冠华吴帅克陈威江西师范大学物理与通信电子学院江西南昌330022

提出一种基于两相交开口谐振环(TI-SRR)的超材料太赫兹带阻滤波器,通过改变TI-SRR线宽、环间间隔和半径大小,探究各参数对滤波器透射系数的影响。研究了超材料太赫兹带阻滤波器三个谐振点处的电场和表面电流分布,进而分析了滤波器的工... 详细信息

提出一种基于两相交开口谐振环(TI-SRR)的超材料太赫兹带阻滤波器,通过改变TI-SRR线宽、环间间隔和半径大小,探究各参数对滤波器透射系数的影响。研究了超材料太赫兹带阻滤波器三个谐振点处的电场和表面电流分布,进而分析了滤波器的工作机理。为了验证理论模型的计算结果,采用微纳光刻技术制备滤波器的实物样品,使用太赫兹时域光谱系统进行测试。结果表明,该滤波器有3个谐振点,谐振频率分别为0.431、0.476、0.934 THz,对应的透射系数(S21)分别为-42.518、-40.331、-14.132 dB,-10 dB阻带带宽分别为0.220 THz和0.026 THz。实测曲线整体趋势与仿真曲线保持一致,阻带特性相较良好,测试结果与仿真结果较为符合。该滤波器在新型通信设备和精密仪器领域有较高的应用价值。

关键词：超材料太赫兹带阻滤波器微纳光刻太赫兹时域光谱

多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

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应用与环境生物学报 2024年第1期30卷 167-175页

作者：郭艺鸣姜君逸潘学玮张显徐美娟杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇... 详细信息

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

关键词：多酶级联转化辅酶循环再生 γ-丁内酯 1,4-丁二醇

大肠杆菌Nissle 1917的多组学分析及其产微菌素的功能验证

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微生物学报 2024年第9期 3238-3252页

作者：汤佳冰张颖叶佳微张显饶志明徐美娟江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

【目的】探究益生大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917, EcN)与模式菌株的代谢及转录差异，为构建工程菌株EcN提供参考，进一步推动食品安全菌株EcN的应用。【方法】软件分析比较EcN和模式菌株BL21(DE3)、W3110的基因组... 详细信息

【目的】探究益生大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917, EcN)与模式菌株的代谢及转录差异，为构建工程菌株EcN提供参考，进一步推动食品安全菌株EcN的应用。【方法】软件分析比较EcN和模式菌株BL21(DE3)、W3110的基因组、转录组差异，并通过质粒构建表达验证；在BL21(DE3)中质粒表达EcN来源的微菌素(microcin)并进行抑菌效果验证。【结果】共挖掘出904个差异编码基因。同时以不同碳源为底物分析验证了不同菌株在碳源吸收利用方面的差异，以启动子Pflic在不同菌株中的表达情况验证了转录调控上的差异；最终构建的微菌素重组菌株在培养12 h时，抑菌率提高了30.3%。【结论】研究一定程度上阐明了EcN的代谢特性及其与模式菌株的转录差异，并为微菌素作为窄谱治疗药物来抑制肠道病原体和减少肠细菌水华的研究提供了思路。

关键词：大肠杆菌 Nissle 1917 多组学分析微菌素

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重组枯草芽孢杆菌全细胞高效催化合成d-甘露糖

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生物工程学报 2024年

作者：刘祖怡乔郅钠杜宇轩石选平尤甲甲饶志明王立江南大学食品学院江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

d-甘露糖是一种在食品、医疗、化妆品等领域都具有很大经济价值和应用价值的天然己糖。但是目前大部分生物合成法都是以大肠杆菌作为宿主，生产过程中存在安全性问题，对后续应用产生了诸多限制。本文通过比较多个来源的甘露糖异构酶的... 详细信息

d-甘露糖是一种在食品、医疗、化妆品等领域都具有很大经济价值和应用价值的天然己糖。但是目前大部分生物合成法都是以大肠杆菌作为宿主，生产过程中存在安全性问题，对后续应用产生了诸多限制。本文通过比较多个来源的甘露糖异构酶的酶学性质，筛选出最优来源甘露糖异构酶。以食品安全级菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168为底盘细胞，将最优来源的甘露糖异构酶进行异源表达，获得了重组菌株B. subtilis 168/pMA5-EcMIaseA，用于以d-果糖为底物全细胞催化高效合成d-甘露糖。通过优化转化温度、pH、底物浓度等条件，提高其转化合成d-甘露糖的效率。结果表明，重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-EcMIaseA在最适转化条件下进行5 L发酵罐全细胞转化，分别以500 g/L果糖和600 g/L果糖为底物，转化6 h，d-甘露糖的产量分别为138.74 g/L和163.30 g/L，转化率分别达到27.75%和27.22%，这是目前报道的以食品级菌株进行d-甘露糖生产的最高产量，为d-甘露糖的工业化安全生产及应用奠定了重要基础。

关键词： d-甘露糖枯草芽孢杆菌甘露糖异构酶全细胞催化

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酿酒酵母启动子工程研究进展

中国生物工程杂志 2023年第11期43卷 78-91页

作者：蒋慧慧王强饶志明张显巢湖学院生物与环境工程学院合肥238024 江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

启动子是起始基因转录的重要元件,启动子的功能与基因表达水平密切相关。启动子工程旨在研究启动子功能改造和定向进化,可以拓展和深化酿酒酵母启动子在合成生物学中的应用。基于酿酒酵母启动子的结构特征,重点综述了酿酒酵母启动子工... 详细信息

启动子是起始基因转录的重要元件,启动子的功能与基因表达水平密切相关。启动子工程旨在研究启动子功能改造和定向进化,可以拓展和深化酿酒酵母启动子在合成生物学中的应用。基于酿酒酵母启动子的结构特征,重点综述了酿酒酵母启动子工程的策略和应用,即调控序列的敲除、传统启动子的随机突变、饱和突变、启动子杂交、合成最小化启动子骨架、转录因子结合位点的修饰和改造等技术原理和研究实例,并结合CRISPR/dCas9和人工智能工具在酿酒酵母启动子工程领域的最新进展,展望启动子工程在合成生物学领域的未来发展方向。

关键词：酿酒酵母转录调控启动子改造 CRISPR/dCas9 人工智能

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谷氨酸棒杆菌不同生长时期非编码sRNA的预测与鉴定

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微生物学报 2023年第10期63卷 3876-3890页

作者：王弋范志豪饶志明徐美娟江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】探究与挖掘不同生长时期谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中潜在的小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)。【方法】检测不同时期和不同工业改造的谷氨酸棒杆菌菌株的RNA-Seq数据构建表达文库,通过sRNA-Detect和AP... 详细信息

【目的】探究与挖掘不同生长时期谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中潜在的小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)。【方法】检测不同时期和不同工业改造的谷氨酸棒杆菌菌株的RNA-Seq数据构建表达文库,通过sRNA-Detect和APERO两种方法构建潜在的sRNA数据库。以逆转录PCR检测(real-time reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测sRNA的表达,并通过生物信息学方法分析潜在sRNA的调控位点、二级结构及保守结构域。【结果】构建了包含2653条潜在sRNA的数据库,依据其相较于编码序列(coding sequence,CDS)区域的位置进行分类、预测功能。发现了在高GC革兰氏阳性菌中普遍存在的sRNA00130,随生长时期表达量变化的sRNA00257,常时高表达的sRNA02036、sRNA02037等sRNA。依据自由结合能预测潜在sRNA可能的结合位点、二级结构,预测结果显示潜在的sRNAs同多种细胞复制、代谢通路基因相关。大多数潜在sRNA仅在谷氨酸棒杆菌中具有保守性。【结论】谷氨酸棒杆菌潜在sRNA的发掘对于填补谷氨酸棒杆菌生长调控机制的空缺具有重要作用,提供了新的可能的调控工具与改造位点。

关键词：谷氨酸棒杆菌小的非编码RNA(sRNA) 生物信息学全基因组分析 sRNA-Detect

基于蛋白表面电荷工程分子改造枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶最适催化pH

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应用与环境生物学报 2023年第1期29卷 7-14页

作者：武文慧刘菲王雅玲杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分... 详细信息

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分别为60℃和65℃,最适催化pH均为弱碱性(分别为pH 8.0和pH 7.5),但在弱碱环境下(pH 7.0-8.0)该酶稳定性较差.为提高BsGDH在催化合成α-酮戊二酸应用中的经济性,基于蛋白表面电荷工程,对该酶进行分子改造,以期将其催化最适pH调至其稳定性较高的中性环境.首先利用ROSETTA软件选择7个突变候选位点,结果发现突变体N16D和K218D催化谷氨酸合成α-酮戊二酸的最适pH由8.0下调至7.0,同时在pH 7.0条件下酶活较野生型分别提高2.9倍和5.4倍,且逆反应还原方向酶活降低.另外,突变体N16D和K218D热稳定性都得到显著改善,50℃下放置3 h后,突变体N16D可以保持54%左右的酶活,K218D保持40%左右的酶活,而野生型酶活此时完全丧失.本研究成功将BsGDH最适催化pH范围下调至其稳定性良好的pH范围.(图10表3参23)

关键词：谷氨酸脱氢酶酶学性质最适pH 表面电荷工程定点突变

不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

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食品与发酵工业 2023年第2期49卷 26-33页

作者： Hero Nmeri Godspower 乔郅钠徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸... 详细信息

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌*** BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株*** BL21/pETDuet1-BcmetK和*** BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌*** BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO_(4)、100 mmol/L K_(2)SO_(4)、45℃、pH 8.0]下,连续转化5 h,获得了464 mg/L的SAM。重组大肠杆菌*** BL21/pETDuet1-CgmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度40 mmol/L、0.8%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、800 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO 4、100 mmol/L K_(2)SO 4、45℃、pH 8.5]下,连续转化5 h,获得了528 mg/L的SAM,可见,谷氨酸棒杆菌来源的SAM合酶催化能力优于蜡状芽孢杆菌来源的,更有利于SAM的合成。该研究成功构建了SAM合成菌株,虽然产量水平不高,但为SAM的可持续生物合成提供了重要借鉴。

关键词：蜡状芽孢杆菌谷氨酸棒杆菌大肠杆菌 S-腺苷甲硫氨酸合酶 S-腺苷甲硫氨酸全细胞催化