利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠Mlk3基因探讨其对血压的影响

作     者：高诗娟 方光明 张燕红 杜杰 GAO Shijuan;FANG Guangming;ZHANG Yanhong;DU Jie

作者机构：首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所北京100029 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2023年第39卷第4期

页      面：1644-1654页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(91939106,81770470) 北京市自然科学基金(7192032) 

主　　题：基因敲除 小鼠 CRISPR/Cas9 混合谱系激酶3 血压 肌球蛋白轻链 

摘      要：为探讨混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3,Mlk3)基因敲除(knockout,KO)对小鼠血压的影响,采用CRISPR/Cas9系统构建Mlk3基因敲除(Mlk3 knockout,Mlk3KO)小鼠模型。T7核酸内切酶I(T7 endonuclease I,T7E1)酶切法验证向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的活性。体外转录CRISPR/Cas9 mRNA及sgRNA,显微注射至受精卵并移植入假孕母鼠。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及DNA测序检测基因型。实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测Mlk3 mRNA表达,Western blotting及免疫荧光检测Mlk3蛋白表达。尾套法监测小鼠血压。免疫组化及Western blotting检测小鼠主动脉肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化水平。PCR基因型鉴定及DNA测序显示Mlk3敲除成功,且Mlk3敲除小鼠未检测到Mlk3蛋白表达,证实CRISPR/Cas9系统成功构建了Mlk3敲除小鼠。Mlk3敲除小鼠在基础状态下血压显著高于同笼对照,且Mlk3敲除小鼠主动脉平滑肌层MLC的磷酸化高于对照组,说明Mlk3具有抗高血压的内源性保护作用。本研究为探讨蛋白激酶Mlk3抗高血压及抗高血压诱导心血管不良重塑的作用机制提供了理想的动物模型。