CRISPR/Cpf1双切刻系统的构建与活性检测

作     者：张权威 都萌萌 翟双双 赵金山 李和刚 ZHANG Quanwei;DU Mengmeng;ZHAI Shuangshuang;ZHAO Jinshan;LI Hegang

作者机构：青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 

出 版 物：《中国畜牧杂志》 (Chinese Journal of Animal Science)

年 卷 期：2023年第59卷第1期

页      面：254-259页

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

基　　金：山东省羊产业技术体系(SDAIT-10-03) 内蒙古自治区科技重大专项(2020ZD0003) 国家自然科学基金(31572383、31301936) 青岛市民生科技计划(19-6-1-68-nsh、19-6-1-63-nsh、21-1-4-ny-8-nsh) 山东省草学一级学科建设经费 青岛农业大学高层次人才引进基金(663/1119050、663/1118027) 

主　　题：CRISPR/Cpf1 双切刻系统 突变体 人工改造 crRNA 

摘      要：Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶,具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crRNA)组成,对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crRNA的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶。然而,其是否适用于构建双切刻系统还有待验证。因此,本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crRNA,进行瞬时转染,利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率;同时探究人工改造的crRNA能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率;以及设计6对具有拓展PAMs序列的crRNA靶向位点,评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率。结果显示:3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性,并具有切割DNA单链的能力。在AsCpf1 crRNA发生突变和延伸后,它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力。HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性,并且可以识别5’-YTN和5’-TYYN PAMs序列,与AsCpf1相比,显著拓宽了其靶向范围。