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Cas12i1-crrna二元复合物的结构生物学研究

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Cas12i1-crRNA二元复合物的结构生物学研究

作者：李煜福建师范大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas（Clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats and CRISPRassociated proteins,规律成蔟的短间隔回文重复序列和CRISPR相关蛋白）系统最早在细菌和古细菌中发现,提供抵抗噬菌体侵染的能力。拥有CRISPR系统的细菌和古细菌能够“记住”曾经入侵的外源核酸信息,并提供适应性免疫能力。经历了近三十载的研究之后,科学家们对CRISPR-Cas系统进行了功能和结构上的区分。由多个Cas蛋白组成Cascade复合体来发挥靶向干扰功能的CRISPR-Cas系统被归为第一大类,这类CRISPR-Cas系统由于基因组较为复杂,且效应复合体由多亚基组成使得其在应用上受到限制。第二大类CRISPR-Cas系统的组成则更为简单,由含有多个结构域的单个Cas蛋白来发挥干扰功能,这类Cas蛋白通常结构较为复杂,多个结构域各自行使不同的功能。由于第二大类CRISPR-Cas系统的组成简单,具备对切割位点的重编程能力,其中最著名的II型CRISPR-Cas9系统在2013年便已有了在哺乳动物细胞中进行基因组编辑的案例。在这之后新发现的V型CRISPR-Cas系统具有与Cas9不同的切割方式,其中Cas12a、Cas12b等均已被成功应用于基因组编辑。对新发现的CRISPR-Cas系统的研究有助于拓展基因组编辑方式,同时对CRISPR的进化分析提供更深入的了解。Cas12i1是第二大类V型CRISPR-Cas系统中新发现的效应蛋白,其切割双链ds DNA底物的非目标链即NTD链（Non Target strand）的活性要明显高于切割目标链即TD链（Target strand）的活性,Cas12i1的这种酶切活性在经过改造之后可用于高特异性的基因组编辑。本文解析了Cas12i1-crrna二元复合物的晶体结构,并对结构进行了详细的分析,结合生化实验,对Cas12i1的功能和机制进行了总结。Cas12i1对DNA底物切割共分为两种不同的机制:Cis（顺式）切割和Trans（反式）切割。Cas12i1的Cis切割活性指的是Cas12i1在crrna的指导下对与crrna互补配对的靶ds DNA的TD链和NTD链进行序列特异性的定向切割,通常使靶ds DNA产生一个错位的双链断裂（Double strand break,DSB）,在体外生化分析实验中我们也观察到Cas12i1对靶ds DNA中对与crrna的非互补链NTD的切割活性要明显高于对与crrna的互补链TD的切割活性。Cas12i1的Trans切割活性则在由crrna与靶ds DNA结合并产生序列特异性的Cis切割之后激活,Cas12i1可以结合环境中的任意单链ss DNA,产生序列非特异性的Trans切割活性,从ss DNA的5’端开始进行连续性的切割。此外,在我们得到的Cas12i1-crrna二元复合物晶体结构中观察到了与crrna结合的来源于大肠杆菌的伪靶寡核苷酸,模拟了靶DNA与crrna的识别。同时在与本实验室其他成员所解析的Cas12i1-crrna-Target三元复合物进行叠合分析后发现二元复合物中的PI（PAM Interaction）结构域在Cas12i1结合靶ds DNA的过程中经历了打开-关闭的动态变化过程,同时也观察到了其它结构域中发生的构象变化以激活Cas12i1的核酸内切酶活性。本研究为Cas12i1开发成为可靠的基因组编辑工具提供了有价值的见解。

关键词： CRISPR-Cas Cas12i1 crrna 晶体结构

RscSR二元调控系统与荚膜多糖在无乳链球菌致病中的作用及crrna对荚膜多糖合成的调控分析

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RscSR二元调控系统与荚膜多糖在无乳链球菌致病中的作用及crRNA对...

作者：聂蒙南京农业大学

学位级别：硕士

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)又称B群链球菌(group B Streptococcus,GBS),可感染包括人、哺乳动物和鱼类在内的多种宿主。近年来,无乳链球菌感染对水产养殖特别是罗非鱼产业造成了巨大的经济损失。然而,该菌致病机制尚不清楚。... 详细信息

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)又称B群链球菌(group B Streptococcus,GBS),可感染包括人、哺乳动物和鱼类在内的多种宿主。近年来,无乳链球菌感染对水产养殖特别是罗非鱼产业造成了巨大的经济损失。然而,该菌致病机制尚不清楚。CRISPR-Cas系统是指广泛存在于细菌和古菌中的规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和与CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)蛋白的统称,该系统不仅能够抵抗外源核酸入侵,为细菌提供获得性免疫,还能通过切割内源性核酸,调节病原菌的毒力。crrna是CRISPR序列转录形成前体RNA(precursor CRISPR RNA,pre-crrna)后,经过进一步加工后形成的成熟RNA,可与Cas9蛋白结合形成复合物,以碱基互补配对的方式,引导Cas9蛋白进行核酸切割。前期研究发现,无乳链球菌GD201008-001的crrna突变株毒力显著下降;转录组测序和q RT-PCR结果显示,预测的二元调控系统RscSR和部分荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)合成基因(cps B、cps C和cps J)的转录水平在Δcrrna中显著上调。本研究在此基础上,利用同源重组技术构建了基因rscSR和cpsE的缺失株与互补株,体内外分析了rscSR和CPS在细菌致病过程中的作用;通过启动子活性分析和m RNA降解试验,分析crrna对CPS的调控作用,并在Δcrrna基础上进一步敲除基因cpsE,探究crrna对CPS的调控作用。1无乳链球菌二元调控系统RscSR的鉴定及其对细菌应激适应性和毒力特性的影响针对鱼源无乳链球菌GD201008-001中推定的二元调控系统(two-component system,TCS)RscSR,利用生物信息学方法对其组成成分Rsc S和Rsc R的三维结构和保守结构域进行分析;构建基因缺失株ΔrscSR与互补株CΔrscSR,测定细菌的生长曲线,检测其耐酸应激、耐氧化应激、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力,同时测定其对巨噬细胞的毒性和对小鼠的毒力。结果显示,RscSR具有典型的TCS结构特点,其中Rsc S具有组氨酸激酶结构域,Rsc R具有反应调节子结构;其编码基因缺失后,菌株耐酸、耐氧化、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力及对巨噬细胞毒性均显著降低,而将该基因回补后各项能力均有所恢复;动物试验表明,野生株感染小鼠19h内全部死亡,而RscSR缺失株感染小鼠全部死亡时间为48h。研究表明,RscSR在无乳链球菌应激适应性以及毒力方面发挥重要作用。2荚膜多糖在无乳链球菌致病过程中的作用利用同源重组技术,构建了GBS的荚膜多糖缺失株ΔcpsE和互补株CΔcpsE,并利用透射电镜和荚膜染色验证了CPS的缺失。随后测定细菌的生长曲线,检测细菌表面疏水性、表面负电荷水平、自凝集能力、生物被膜形成能力、抗巨噬细胞吞噬和对细胞的黏附与侵袭能力。结果显示,荚膜多糖编码基因缺失后,各菌株间生长速率并未表现出明显的差异,而细菌表面疏水性、细菌自凝集能力、生物被膜形成能力和对细胞的黏附与侵袭能力显著升高,细菌表面负电荷水平、抗巨噬细胞吞噬能力显著降低。细菌印迹试验结果表明,CPS缺失株与全菌抗血清反应的信号增强,表明CPS缺失暴露了GBS表面的免疫相关因子。小鼠毒力试验表明,ΔcpsE感染后48h内小鼠100%存活,而野生株感染后小鼠在30h内全部死亡,说明CPS是GBS重要的毒力因子。组织细菌载量试验表明,ΔcpsE感染小鼠20h后脑、血液和脾脏中无活细菌,而在野生株感染的小鼠各脏器中却大量存在,说明CPS缺失导致GBS在宿主体内的增殖能力明显降低。研究表明,CPS可抑制GBS对宿主的定殖和侵袭能力,但有助于细菌在宿主体内的增殖,是细菌重要的毒力因子。3无乳链球菌crrna对荚膜多糖合成的调控作用为了探究crrna对无乳链球菌GD201008-001荚膜多糖合成的调控机制,利用q RT-PCR技术检测了CPS合成基因簇中的7个基因(cps A、cps B、cps C、cpsE、cps J、cps K和neu A)的转录水平,利用唾液酸(SA)测定试剂盒检测了野生株、Δcrrna和CΔcrrna的CPS生成水平,结果表明crrna可以负调控CPS合成基因簇中基因的转录水平,抑制CPS的生成。为进一步探究crrna抑制细菌CPS生成的调控机制,通过利福平处理测定了野生株、Δcrrna和CΔcrrna中cps A和cpsE的m RNA降解速率,结果显示crrna调控CPS生成的机制不是通过直接引导Ca

关键词：无乳链球菌二元调控系统荚膜多糖 crrna 毒力调控

结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达纯化、结晶及其与crrna的相互作用

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结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达纯化、结晶及其与CrRNA的相互作用

作者：王跃福建农林大学

学位级别：硕士

目前由世界卫生组织报道，在2010年，全世界900万人患结核病，140万人死亡，而这其中95%发生在发展中国家。我国每年新发结核病人数占全球总数的17%，位居世界第二。因此,对于结核病的病原体——结核分枝杆菌——的致病机理以及免疫机... 详细信息

目前由世界卫生组织报道，在2010年，全世界900万人患结核病，140万人死亡，而这其中95%发生在发展中国家。我国每年新发结核病人数占全球总数的17%，位居世界第二。因此,对于结核病的病原体——结核分枝杆菌——的致病机理以及免疫机制展开深入研究显得尤为重要。 HtpG是原核生物重要的分子伴侣，在抵御外界压力的过程中有着重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御环境压力。其独特的性质使它成为治疗的良好分子靶点。对于HtpG及其在结核分枝杆菌中的深入研究可以对结核病的治疗以及防治提供新的思路。 CRISPR系统是结核分枝杆菌中的一种适应性免疫系统，对菌体消灭外来质粒和噬菌体以及抵抗和阻止质粒及噬菌体的繁殖有着不可忽视的作用。近年来有报道称，HtpG对大肠杆菌中的CRISPR/Cas(CRISPR-associated)系统是必需的。如果HtpG缺失，CRISPR系统将丢失在溶原作用中抵御噬菌体的感染的自杀行动并且丢失了免疫能力。然而，当HtpG被回补后，CRISPR/Cas系统丢失的活性得到了恢复。依据现有的一些研究成果，预测结核分枝杆菌中同样存在CRISPR系统，并且HtpG对CRISPR系统的活性有作用。结核分枝杆菌中Rv2299c基因对应的蛋白即HtpG。本文据此，在生物信息学分析的基础上，提取结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板，对结核分枝杆菌H37Rv标准株中的Rv2299c基因进行克隆以及融合表达，构建了原核重组表达质粒pET28a-Rv2299c，并且在原核中高效表达。对纯化后的融合蛋白进行了结晶实验，初筛长出来了棒状晶体。同时，将Rv2299c连接到了穿梭载体pMV261H中，并转入了耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，采用抗his标签的抗体检测重组子已正确表达HtpG蛋白。在CRISPI数据库得到结核分枝杆菌H37Rv的CRISPR的预测序列，选取一段CRISPR的序列，在RNA fold web server中预测其RNA二级结构。通过合成模板，PCR扩增后在体外转录成RNA。RNA经过纯化后将其进行去磷酸化处理，使用T4多聚核苷酸激酶在5’端加上γ-P ATP标记后，与HtpG蛋白进行孵育。经非变性胶检测，放射性显影确定了HtpG蛋白和所选取的CRISPR的序列有相互结合的作用。

关键词：结核分枝杆菌高温蛋白G 定期间隔开的短回文重序列丛集 crrna

CRISPR-Cas系统中crrna产生及干扰机制的研究

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生命科学 2016年第5期28卷 584-591页

作者：赵宏图王艳丽中国科学院生物物理研究所中国科学院核酸生物学重点实验室

CRISPR-Cas系统是近年来在细菌和古菌中发现的一种获得性免疫防御系统。利用这种系统,细菌和古菌可以有效地识别并且降解入侵的核酸。在此过程中,细菌和古菌需要产生一种非编码核酸——cr RNA,并且在cr RNA的引导下,由多种Cas蛋白一起... 详细信息

CRISPR-Cas系统是近年来在细菌和古菌中发现的一种获得性免疫防御系统。利用这种系统,细菌和古菌可以有效地识别并且降解入侵的核酸。在此过程中,细菌和古菌需要产生一种非编码核酸——cr RNA,并且在cr RNA的引导下,由多种Cas蛋白一起协同工作,共同实现对外源核酸的捕获和清除。基于近几年的研究进展,现对cr RNA的产生和干扰机制进行了综述,同时对今后的研究方向进行了展望。

关键词： CRISPR-Cas crrna Cas6 Cas9 Cascade

Structural basis of negative regulation of CRISPR-Cas7-11 by TPR-CHAT

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Signal Transduction and Targeted Therapy 2024年第6期9卷 2716-2725页

作者： Tian Hong Qinghua Luo Haiyun Ma Xin Wang Xinqiong Li Chongrong Shen Jie Pang Yan Wang Yuejia Chen Changbin Zhang Zhaoming Su Haohao Dong Xiaodi Tang Department of Laboratory Medicine State Key Laboratory of BiotherapyNational Clinical Research Center for GeriatricsWest China HospitalSichuan UniversityChengduChina Frontiers Medical Center Tianfu Jincheng LaboratoryWest China HospitalSichuan UniversityChengduChina

CRISPR‒Cas7-11 is a Type Ⅲ-E CRISPR-associated nuclease that functions as a potent RNA editing ***-peptide repeat fused with Cas/HEF1-associated signal transducer(TPR-CHAT)acts as a regulatory protein that interacts with CRISPR RNA(crrna)-bound Cas7-11 to form a CRISPR-guided caspase complex(Craspase).However,the precise modulation of Cas7-11’s nuclease activity by TPR-CHAT to enhance its utility requires further ***,we report cryo-electron microscopy(cryo-EM)structures of Desulfonema ishimotonii(Di)Cas7-11-crrna,complexed with or without the full length or the N-terminus of *** structures unveil the molecular features of the Craspase *** analysis,combined with in vitro nuclease assay and electrophoretic mobility shift assay,reveals that DiTPR-CHAT negatively regulates the activity of DiCas7-11 by preventing target RNA from binding through the N-terminal 65 amino acids of DiTPR-CHAT(DiTPR-CHAT_(NTD)).Our work demonstrates that DiTPRCHAT_(NTD) can function as a small unit of DiCas7-11 regulator,potentially enabling safe applications to prevent overcutting and offtarget effects of the CRISPR‒Cas7-11 system.

关键词： CRISPR crrna TPR

基于CRISPR/Cas13的RNA编辑系统及其在核酸检测中的应用

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广东农业科学 2020年第11期47卷 243-251页

作者：张爱霞朱庆锋陈沛于洋魏文康晏石娟刘文华广东省农业科学院农业生物基因研究中心广东广州510640

核酸检测技术在农业、医药、环境等多个领域均有广泛应用,传统的核酸检测技术存在设备昂贵、操作复杂和灵敏度低等诸多局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因13(CRISPR/Cas13)是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统,能在CRISPR RNA... 详细信息

核酸检测技术在农业、医药、环境等多个领域均有广泛应用,传统的核酸检测技术存在设备昂贵、操作复杂和灵敏度低等诸多局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因13(CRISPR/Cas13)是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统,能在CRISPR RNA(crrna)引导下特异切割单链靶RNA,并有非特异性的“附带切割”能力。基于CRISPR/Cas13的核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作方便、成本低廉等优点,具有广阔的应用前景。阐述了CRISPR/Cas13系统的类别归属及其亚型,组分特征及其分子作用机制,介绍了基于CRISPR/Cas13系统的特异性高灵敏度酶报告解锁(SHERLOCK)技术的产生和发展,综述了CRISPR/Cas13系统在病原体检测、耐药突变检测、物种识别和转基因鉴定方面的应用,同时指出了目前基于CRISPR/Cas13核酸检测技术存在的问题,并对未来应用进行了展望。

关键词： CRISPR/Cas13 crrna 核酸检测 SHERLOCK技术分子机制

环形泰勒虫SHERLOCK-LF检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1182-1187页

作者：苏书晓赵帅阳刘军龙张楚晗朱浩瀚关贵全殷宏罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学江苏扬州225009

为快速、准确、简便地对环形泰勒虫感染进行检测,选取环形泰勒虫子孢子表面抗原基因作为靶标分子,设计特异性RPA引物及crrna(CRISPR RNA)序列,建立环形泰勒虫的特异性高灵敏酶报告基因解锁(specific high-sensitive enzymatic reporter ... 详细信息

为快速、准确、简便地对环形泰勒虫感染进行检测,选取环形泰勒虫子孢子表面抗原基因作为靶标分子,设计特异性RPA引物及crrna(CRISPR RNA)序列,建立环形泰勒虫的特异性高灵敏酶报告基因解锁(specific high-sensitive enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)-LF检测方法,并分析该方法的特异性、敏感性和符合率。结果显示:该方法可特异性检测环形泰勒虫基因组,与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫基因组均无交叉反应,且检测灵敏度达到1.42 copies/μL;与行业标准PCR方法检测结果相比,其符合率达到86.96%。本研究建立的SHERLOCK-LF检测方法可在1.5 h内完成对环形泰勒虫的检测,为该病的现场诊断及防控提供了技术支撑。

关键词：环形泰勒虫 RPA Cas13a crrna 侧向流试纸条

CRISPR/Cpf1双切刻系统的构建与活性检测

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中国畜牧杂志 2023年第1期59卷 254-259页

作者：张权威都萌萌翟双双赵金山李和刚青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109

Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶,具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crrna)组成,对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crrna的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变... 详细信息

Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶,具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crrna)组成,对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crrna的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶。然而,其是否适用于构建双切刻系统还有待验证。因此,本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crrna,进行瞬时转染,利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率;同时探究人工改造的crrna能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率;以及设计6对具有拓展PAMs序列的crrna靶向位点,评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率。结果显示:3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性,并具有切割DNA单链的能力。在AsCpf1 crrna发生突变和延伸后,它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力。HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性,并且可以识别5’-YTN和5’-TYYN PAMs序列,与AsCpf1相比,显著拓宽了其靶向范围。

关键词： CRISPR/Cpf1 双切刻系统突变体人工改造 crrna

基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2022年第8期42卷 1119-1124页

作者：邝振展肖斌孙朝晖罗镕何洁雯李林海中国人民解放军南部战区总医院检验科广东广州510010 广州医科大学附属第六医院(清远市人民医院)检验医学部广东清远511518 广州医科大学金域检验学院广东广州510180 广州南方学院云康医学与健康学院广东广州510970

目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crrna长度和浓度进行优化,初步建立基于... 详细信息

目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crrna长度和浓度进行优化,初步建立基于CRISPR/Cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆ctDNA,评价CRISPR/Cas13a方法的检测灵敏度。结果:建立的CRISPR/Cas13a方法成功检测出产物大小为368 bp的TP53R248W片段;在0.05~0.25μmol/L浓度范围内,crrna浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×10~4拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的CRISPR/Cas13a方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。

关键词： CRISPR/Cas13a TP53 R248W crrna 快速检测