MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

作     者：刘仪 牛宏红 杨赛丽 曹旭东 袁俐 LIU Yi;NIU Honghong;YANG Saili;CAO Xudong;YUAN Li

作者机构：石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室新疆石河子832000 

出 版 物：《石河子大学学报（自然科学版）》 (Journal of Shihezi University(Natural Science))

年 卷 期：2022年第40卷第5期

页      面：620-626页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(81560264) 

主　　题：耻垢分枝杆菌 MSMEG_0372基因 基因敲除 基因回补 基因过表达 

摘      要：目的为研究MSMEG_0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,***)并鉴定。方法聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG_0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates,AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至***,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染***,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG_0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG_0372基因,构建pMV361-MSMEG_0372质粒。将pMV361-MSMEG_0372质粒分别导入MSMEG_0372基因敲除菌株和野生型***,构建MSMEG_0372基因回补菌株和MSMEG_0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果PCR扩增出MSMEG_0372的左、右臂(AES),构建了p0004s-AES质粒和phAE159-AES噬菌粒,制备了高滴度的重组噬菌体并侵染***,从而成功构建了MSMEG_0372基因敲除菌株。构建了pMV361-MSMEG_0372质粒,成功构建了MSMEG_0372基因回补和过表达菌株。结论成功构建并鉴定了MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达***,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。