CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞单质粒基因敲除方法首次编辑免疫相关基因HLA-DRA

作     者：蔡波 李晓晓 张凌寒 刘彦星 毛跟红 Cai Bo;Li Xiaoxiao;Zhang Linghan;Liu Yanxing;Mao Genhong

作者机构：郑州大学医学科学院河南省郑州市450014 郑州大学第二附属医院河南省郑州市450014 

出 版 物：《中国组织工程研究》 (Chinese Journal of Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2023年第27卷第15期

页      面：2356-2362页

学科分类：07[理学] 08[工学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090102[农学-作物遗传育种] 0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 0901[农学-作物学] 100215[医学-康复医学与理疗学] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(81971454) 项目负责人:毛跟红 

主　　题：CRISPR/Cas9 HLA-DRA 基因敲除 HEC-1-A 转录组测序 

摘      要：背景:HLA-DR基因异常表达与多种肿瘤的进展及预后相关,采用CRISPR/Cas9技术编辑子宫内膜癌HLA-DRA基因的研究目前国内外尚未见报道。目的:利用CRISPR/Cas9技术对HEC-1-A细胞的HLA-DRA基因靶向敲除,检测其敲除效率,并初步探索HLA-DRA基因的功能。方法:根据HLA-DRA基因序列,针对HLA-DRA外显子设计单链向导RNA(sgRNA),分别将sgRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至YKO载体中,通过脂质体将sgRNA表达质粒转染到HEC-1-A细胞中。根据荧光表达,观察评估sgRNA敲除效果后,使用表达sgRNA的质粒进行转染,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得稳定的绿色荧光蛋白阳性表达细胞后,进行PCR、基因测序、转录组测序。结果与结论:经转染和嘌呤霉素筛选后,获得稳定表达绿色荧光蛋白的HEC-1-A细胞,对其进行Sanger测序分析,结果显示HEC-1-A细胞中HLA-DRA第一号外显子基因被定向敲除,对转录组测序结果进行差异基因筛选,根据筛选所得686个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,构建蛋白互作网络图,通过对肿瘤增殖分化有关差异基因分析发现COL3A1、BCL2A1、TACSTD2、CXCR2等基因表达上调,GNG11、BMP7、IL1RN、PLEK2、CDH6等基因表达下调。结果可见,HLA-DRA基因参与了多种器官、组织和细胞的功能调控过程。此外,HLA-DRA基因可能通过2种途径(上调/下调)调控子宫内膜腺癌细胞的增殖、分化、迁移及侵袭过程。此研究建立了CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞的单质粒基因敲除方法,首次敲除子宫内膜癌免疫相关基因HLA-DRA,为子宫内膜癌免疫治疗的研究奠定实验基础。