H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1_P亚基片段的表达、纯化和结晶

作     者：范克伟 庞海 陈吉龙 黄志勇 吴德峰 FAN Ke-wei;PANG Hai;CHEN Ji-long;HUANG Zhi-yong;WU De-feng

作者机构：福建农林大学生命科学学院福建福州350002 清华大学医学院北京100084 中国科学院微生物研究所北京100101 福建农林大学动物科学学院福建福州350002 

出 版 物：《家畜生态学报》 (Journal of Domestic Animal Ecology)

年 卷 期：2012年第33卷第2期

页      面：31-36页

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主　　题：流感病毒H5N1 PB1_P 克隆 表达纯化 蛋白结晶 

摘      要：根据GenBank中H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒的PB1_P基因,克隆到原核表达载体pET-28a载体中,经PCR、酶切和测序分析后,鉴定出阳性重组子。将阳性质粒pET-28a/PB1_P转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.5mol/L IPTG,在37℃诱导表达4h,经SDS-PAGE和Western-blot检测,获得重组蛋白PB1_P表达。并经Ni-NTA柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白,采用悬滴气相扩散法对纯化蛋白进行结晶。结果成功构建pET-28a/PB1_P重组质粒,SDS-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,Western-blot证明表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,经蛋白纯化、初筛结晶,得到PB1_P重组蛋白初筛晶体,为深入研究流感病毒聚合酶的生物学功能、开发新型H5N1亚型禽流感病毒检测试剂盒奠定了良好的基础。