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人心肌肌球蛋白轻链1的克隆、表达纯化和单抗制备

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2000年第2期32卷 158-162页

作者：黄人健彭宝珍周国瑛龚祖埙中国科学院上海生物化学研究所!上海200031

报道了中国人心肌肌球蛋白轻链 1cDNA的核苷酸序列 ,并由此推算的氨基酸序列。与国外发表的人心肌肌球蛋白轻链的氨基酸序列比较 ,发现有两处差异 ,即在 2 4位 ,由谷氨酸变为丙氨酸 ,而从 98位起至 10 1位有 4个氨基酸序列的连续差异 ,... 详细信息

报道了中国人心肌肌球蛋白轻链 1cDNA的核苷酸序列 ,并由此推算的氨基酸序列。与国外发表的人心肌肌球蛋白轻链的氨基酸序列比较 ,发现有两处差异 ,即在 2 4位 ,由谷氨酸变为丙氨酸 ,而从 98位起至 10 1位有 4个氨基酸序列的连续差异 ,即由天冬酰胺精氨酸丝氨酸赖氨酸变为赖氨酸脯氨酸精氨酸谷氨酰胺 ,推测可能是由于人种差异而引起的。利用该cDNA在大肠杆菌内的表达产物 ,已获得一株高效的抗中国人心肌肌球蛋白轻链 1的单克隆抗体 ,利用该单克隆抗体和表达抗原 ,已组成能用以检测人心肌疾病的诊断药盒 ,并为今后进一步对人心肌肌球蛋白轻链 1的功能研究打下良好的基础

关键词：人心肌肌球蛋白轻链1 克隆和序列分析表达纯化单克隆抗体

来源于嗜热氢化杆菌的新型对苯二甲酸双(羟乙)酯水解酶的表达纯化与酶学性质

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生物工程学报 2023年第5期39卷 2015-2026页

作者：陈阳阳高健赵夷培王浩韩旭张洁顾群侯颖刘卫东河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471000 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程研究中心天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308 天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院大学北京100049

石化来源的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)被广泛用于矿泉水瓶、食品包装和纺织品等领域,因其在自然界中不易分解,大量使用后的PET废弃物造成了严重的环境污染与资源浪费。使用生物酶法对PET废弃物进行解聚,并对... 详细信息

石化来源的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)被广泛用于矿泉水瓶、食品包装和纺织品等领域,因其在自然界中不易分解,大量使用后的PET废弃物造成了严重的环境污染与资源浪费。使用生物酶法对PET废弃物进行解聚,并对解聚产物进行升级循环利用是进行塑料污染治理的重要方向之一,其中关键的是PET水解酶的解聚效率。对苯二甲酸双(羟乙基)酯(bis(hydroxyethyl)terephthalate,BHET)是PET生物酶解的中间产物,其累积是限制PET水解酶催化效率的一个重要因素,BHET水解酶和PET水解酶的联用能提升PET的整体水解效率。来源于嗜热氢化杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)的双烯内酯酶(HtBHETase)对BHET有显著水解效果,将该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达并纯化后,对其酶学性质进行了研究。结果显示,HtBHETase对短碳链的酯类如对硝基苯酚乙酸酯催化活性较高,HtBHETase以BHET为底物时的最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55℃;该酶有较好的热稳定性,经80℃的条件处理1 h仍能保持80%以上活性,显示出了良好的热稳定性,HtBHETase有在PET塑料生物解聚中使用的潜力,本研究为推动生物酶法降解PET提供了新的参考。

关键词：对苯二甲酸双(羟乙基)酯水解酶表达纯化酶学性质

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

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生物工程学报 2017年第11期33卷 1827-1839页

作者：何华伟王叶菁宋凯王姣位曙光赵朋赵萍西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 西南大学生物技术学院重庆400715

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.***.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP... 详细信息

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.***.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。

关键词：家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶克隆表达纯化结构

家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

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生物工程学报 2017年第7期33卷 1109-1123页

作者：何华伟王叶菁赵敏健位曙光赵朋蒋文超刘莉娜赵萍西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 西南大学生物技术学院重庆400715

精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学... 详细信息

精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。

关键词：家蚕精氨酸激酶表达纯化结构活性

古尔图病毒核蛋白的原核表达纯化及ELISA检测方法的建立

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中华预防医学杂志 2022年第6期56卷 824-830页

作者：蒋柏勇阿来·沙力塔那美丽排提·玉素甫张敬媛王俊忠邓菲张渝疆孙素荣新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046 中国科学院武汉病毒研究所武汉430064 华中科技大学同济医学院附属协和医院武汉430022 新疆疾病预防控制中心乌鲁木齐830092

目的获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原,并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法人工合成密码子优化的GTV-NP编码基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒,转化至BL21(DE3)。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot... 详细信息

目的获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原,并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法人工合成密码子优化的GTV-NP编码基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒,转化至BL21(DE3)。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原,建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法,并对其进行评价和初步应用。结果成功构建原核表达质粒pET32a-NP,重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,大小约为44 kD,Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性;检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论建立的GTV NP抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。

关键词：核蛋白类酶联免疫吸附测定血清学试验表达纯化古尔图病毒

牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

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华西口腔医学杂志 2015年第6期33卷 607-612页

作者：邱伟程兴群周学东李雨庆口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院(四川大学) 成都610041

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将... 详细信息

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒p ET28a连接,分别构建出重组表达质粒p ETpgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒p ET-pgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与Gen Bank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·m L-1。结论本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。

关键词：牙龈卟啉单胞菌 c-di-AMP 代谢基因表达纯化

沙粒病毒聚合酶C端的表达纯化与结晶条件筛选

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中国生物工程杂志 2019年第12期39卷 18-23页

作者：景佳美徐欣王敏彭如超施一中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院大学存济医学院北京100049

拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端... 详细信息

拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端负责结合宿主mRNA帽子。目前对哺乳动物沙粒病毒聚合酶C端的特征知之甚少。为此构建了拉沙病毒和马秋波病毒聚合酶C端的重组表达载体,并利用E. coli原核系统进行表达和后续纯化,获得了不同聚体形式的C端蛋白,通过分析超速离心实验和负染电镜观察对其不同的聚体形式进行了表征。最后通过大量筛选结晶条件,得到了拉沙病毒聚合酶C端的晶体,为进一步研究其三维结构和功能机制奠定了基础。

关键词：拉沙病毒马秋波病毒聚合酶C端表达纯化结晶

重组人干扰素Epsilon的表达纯化及生物学性质研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第3期19卷 227-231页

作者：彭夫望高寒春谢志平张辉李启明段招军侯云德中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室 100052

目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFNε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究。方法人工合成rhIFNε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达。... 详细信息

目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFNε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究。方法人工合成rhIFNε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达。将表达的包涵体蛋白纯化复性后,对最终产物的抗病毒活性、细胞生长抑制活性和NK细胞刺激活性进行鉴定。同时,利用芯片技术,从基因的水平对rhIFNε155ser的生物机制进行初步的了解。结果rhIFNε155ser以包涵体的形式表达,经纯化蛋白纯度可达95%。复性后rhIFNε155ser在WISH抗VSV系统中的抗病毒活性可达6×105IU/mg。在100～1000pg/ml下rhIFNε155ser具有剂量依赖性的抗增殖活性,而NK细胞刺激活性无剂量依赖性。基因芯片扫描发现,22278个位点中,有283个基因显著上调,另外1894个显著下降。结论成功地表达了rhIFNε155ser,发现此IFN具有一定的抗病毒、抗增殖和NK细胞刺激活性。芯片技术可进一步拓展对IFN的功能研究。

关键词：重组人干扰素 Epsilon 表达纯化生物学性质基因序列基因芯片

蛋白激酶Cδ的克隆表达纯化及其在药物先导化合物筛选中的初步应用

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生物工程学报 2005年第2期21卷 300-304页

作者：陈樑张红锋华东师范大学生命科学学院

蛋白激酶C家族是一类磷脂酰丝氨酸依赖丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。PKCδ(蛋白激酶Cδ)是蛋白激酶C家族成员。PKCδ的异常激活将会导致糖尿病和多种癌症的发生 ,因此 ,PKCδ的特异性抑制剂能成为治疗这些疾病的潜在药物 ,如能以PKCδ为分... 详细信息

蛋白激酶C家族是一类磷脂酰丝氨酸依赖丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。PKCδ(蛋白激酶Cδ)是蛋白激酶C家族成员。PKCδ的异常激活将会导致糖尿病和多种癌症的发生 ,因此 ,PKCδ的特异性抑制剂能成为治疗这些疾病的潜在药物 ,如能以PKCδ为分子靶点来筛选特异性抑制剂 ,就可以建立癌症及糖尿病的药物先导化合物筛选模型。通过RT_PCR的方法 ,克隆了鼠源的PKCδ,并构建了哺乳动物细胞表达载体 ,获得了可稳定表达PKCδ的COS1细胞株。通过亲和吸附的方法获得了较为纯净的PKCδ ,并对酶学活性作了进一步的分析 ,建立了以PKCδ为靶点的药物先导化合物筛选模型。

关键词：蛋白激酶Cδ 表达纯化激酶活性分析