检索结果-南通市图书馆

作者：郝荣增西北农林科技大学

学位级别：硕士

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升... 详细信息

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升高。但羊水平衡的分子机制仍不清楚。目前研究认为羊水膜内转运吸收是维持羊水稳态平衡的重要方式,但其分子机制尚不清楚。水通道蛋白(Aquanproin, AQP)是一族介导水跨膜转运的膜孔蛋白,在机体内器官的液体平衡中发挥着关键作用,但其在羊水平衡中的作用机理还不清楚。RNA干扰技术是近年来用于哺乳动物细胞培养研究的新方法,用以使目的基因表达沉默,进而分析其功能。人羊膜WISH细胞株源于正常足月妊娠的人羊膜上皮细胞。为了研究AQP在母胎液体平衡的作用,建立研究羊膜AQPs在羊水量平衡中作用及其调节机制的细胞模型,本研究应用RNA干扰技术研究特异性siRNA(small interference RNA)对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用。结果如下: 1.本研究运用RT-PCR和细胞免疫荧光化学技术,检测人羊膜WISH细胞中AQP1, 3, 8, 9的表达,结果表明AQP1, 3, 8, 9在人羊膜上皮WISH细胞均有表达,AQP1, 3, 8, 9 mRNA的表达水平分别约为0.489±0.103, 0.594±0.093, 0.474±0.136, 0.425±0.150( x±S)。细胞免疫荧光技术在蛋白水平显示AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞表达。结论认为,WISH细胞可以作为研究羊膜水通道蛋白对水转运及调控机制的细胞模型。 2.本研究运用0 nmol/L, 5 nmol/L, 10 nmol/L, 20 nmol/L和30 nmol/L CY3-Negative siRNA转染人羊膜上皮WISH细胞,以确定其转染效率。转染后24 h,荧光显微镜观察细胞内可见红色荧光,而对照组未见到荧光信号,说明化学合成siRNA可以被有效转入细胞,荧光为特异性荧光信号。流式细胞仪检测转染效率分别为:0, 7.7%, 39.35%, 87.27%和95.78%;20 nmol/L和30 nmol/L转染组的转染效率显著高于5 nmol/L和10 nmol/L组(P0.05)。运用20 nmol/L的Negative siRNA转染细胞24 h后,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测转染对细胞凋亡的影响,结果转染组和对照组细胞早期凋亡率分别为1.96%和2.36%,两组之间细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)。结论认为,20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果;转染效率随siRNA浓度增加而升高;化学合成siRNA转染对细胞凋亡无明显影响。 3.本研究应用化学合成的3条不同序列AQP1-siRNA,终浓度均为20 nmol/L,分别转染细胞24 h,筛选抑制效率最高的siRNA,结果表明AQP1-siRNA-1抑制作用最强;然后分别应用20 nmol/L, 40 nmol/L, 60 nmol/L和80 nmol/L的AQP1-siRNA-1转染细胞,研究不同浓度的siRNA对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用;转染24 h后荧光定量PCR检测,结果各组AQP1 mRNA的表达水平分别降低20.42%, 39.86%, 60.34%和65.81%;阴性对照组AQP1 mRNA表达为空白组的95.7%,与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。 4.本研究运用60 nmol/L AQP1-siRNA-1转染细胞,转染分别培养24 h, 48 h和72 h,研究siRNA的有效作用时间。荧光定量PCR检测结果发现,各组AQP1 mRNA分别较空白组下调60.24%, 90.57%, 87.68%。以48 h转染组AQP1 mRNA表达降低最为显著(P0.05)。结论认为,siRNA对AQP1 mRNA表达的抑制作用在24 h2 h呈时间依赖性升高,最大抑制作用在48 h,有效抑制时间达72 h。总之,本研究检测了AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞的表达,优化了siRNA转染WISH细胞的条件,筛选出有效抑制AQP1 mRNA表达的siRNA序列;最后应用AQP1-siRNA成功抑制了WISH细胞AQP1 mRNA表达,建立了AQP1基因沉默的羊膜上皮细胞模型。

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奶山羊均衡产奶配套技术研究与应用（Ⅰ）

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作者：宋爱爱西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着社会经济发展和人民生活水平提高,以及一些特殊人群对鲜羊奶的需要,如何解决城乡居民全年鲜奶供应是目前奶山羊养殖业所面临的亟待解决的问题。本试验安排受试羊群在每年的8月份年2月份,每隔2个月对奶山羊分批施行同期发情或诱导发... 详细信息

随着社会经济发展和人民生活水平提高,以及一些特殊人群对鲜羊奶的需要,如何解决城乡居民全年鲜奶供应是目前奶山羊养殖业所面临的亟待解决的问题。本试验安排受试羊群在每年的8月份年2月份,每隔2个月对奶山羊分批施行同期发情或诱导发情,以实现分期配种,产羔母羊在全年的不同时期产奶,保证全群母羊在一个年度内均衡供奶。为保证不同季节产羔母羊乳品质达标,分别对不同季节产羔母羊的初乳免疫球蛋白和常乳乳成分进行监测,以便为调整日粮供应和饲养方式提供基本资料。为保证不同季节出生羔羊的正常生长发育,分别对不同季节出生的羔羊进行生长发育监测,为对不同季节出生羔羊采取相应的羔羊培育措施奠定基础。最终建立以奶山羊群体全年均衡产奶为目的的奶山羊全年均衡产奶配套技术体系,并推广应用于奶山羊生产实践。研究工作取得了以下研究结果:1.奶山羊的分批配种。分为8月、10月、12月和次年2月四个批次对奶山羊进行同期发情或诱导发情处理,发情率分别达到了93.75%、93.62%、73.33%、47.62%;前两批次采用的是NRID+PMSG(FSH)+PG法,取得较高的发情率;后两批次采用的是一次同时注射氯前列烯醇和FSH的方法,得到的发情率低,尤其是第四批次的发情率相当低,主要原因一方面2月份是奶山羊的非繁殖季节,另一方面后两批经产羊均是前两批配种未成功遗留下来的很有可能患有卵巢囊肿等障碍性繁殖疾病的羊只。前三批次总妊娠率分别是43.90%、64.29%、60.00%,第四批次母羊将在7月份产羔。第一批次的总妊娠率远低于第二、第三批次的总妊娠率,主要是因为8月份是酷暑季节,造成了种公羊的热应激,以及养殖场种公羊饲养管理不当,二者均导致种公羊精液质量差,精子活力低,所以妊娠率低。总之,分批措施是可行的,但同期或诱导发情方法以及人工授精方法的选择要考虑季节、个体情况等结合生产实践进行综合考虑选择应用。2.奶山羊乳成分监测。采集产羔母羊0d,2d,5d,7d的初乳乳汁,进行免疫球蛋白A和免疫球蛋白G的含量,结果显示8月份配种1月份产羔母羊和10月份配种3月份产羔母羊0 d,2 d,5 d,7 d的初乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白G含量之间无显著差异(P>0.05)。采集8月份配种次年1月份产羔母羊和10月份配种次年3月份产羔母羊第7d、9d、30d、60d的乳汁进行乳蛋白、乳脂肪、总脂固形物、乳糖等主要乳成分的检测,检测结果显示8月份配种次年1月份产羔母羊和10月份配种次年3月份产羔母羊的主要乳成分之间无显著差异(P>0.05)。8月份配种次年1月份产羔母羊的乳质与10月份配种次年3月份产羔母羊的主要乳成分所占百分率在正常值范围内,乳质均达标。乳成分监测保证不同季节产羔母羊的乳品质。3.奶山羊羔羊培育。通过日增重数据分析,8月份配种次年1月份产羔母羊和10月份配种次年3月份产羔母羊所产羊羔从初生到45日龄的体重生长规律无显著差异(P>0.05)。由此可知对羔羊进行代乳料的哺喂是可行的,对羔羊的生长发育影响不大。对羔羊进行生长发育监测是羔羊培育的一种监测手段,根据羔羊生长发育监测可提出建设性的羔羊饲养管理指导建议。

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山羊卵母细胞体外成熟与老化的研究

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作者：赵晓鹏西北农林科技大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵泡中的卵母细胞被长期阻滞在第一次减数分裂前期的双线期，伴随着卵泡的生长，卵母细胞开始生长发育。充分生长的卵母细胞如果脱离卵泡的抑制，就能自发恢复减数分裂，完成核成熟与胞质成熟，只有核质都达到成熟的卵母细胞才... 详细信息

哺乳动物卵泡中的卵母细胞被长期阻滞在第一次减数分裂前期的双线期，伴随着卵泡的生长，卵母细胞开始生长发育。充分生长的卵母细胞如果脱离卵泡的抑制，就能自发恢复减数分裂，完成核成熟与胞质成熟，只有核质都达到成熟的卵母细胞才具备成功受精和支持胚胎发育的能力。成熟后的卵母细胞一般都停滞于第二次减数分裂中期（Metaphase II, MII期），直到受精或给予适当刺激时才能解除停滞并恢复第二次减数分裂。若MII期的卵母细胞不能及时受精或激活，就会发生老化。老化卵母细胞会表现出多种形态结构的改变与功能状态的下降，严重影响卵母细胞受精以及后期胚胎的发育。本研究以山羊卵母细胞为对象，通过多种方法对卵母细胞体外培养过程中的培养液体积、卵母细胞成熟（包括核成熟与胞质成熟）以及老化进行了系统的研究。结果如下： 1.在按照COCs1枚/4μL成熟培养液的培养密度下，比较了不同培养液体积（50，100，250，500μL和1000μL）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，山羊卵母细胞经过体外成熟培养后，100μL和250μL组的卵母细胞成熟率分别为78.10%和74.62%，其差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他各组(P 0.05)。 3.利用皮质颗粒染色和透射电镜技术对卵母细胞的胞质成熟进行检测。结果表明，在培养前，所有卵母细胞的皮质颗粒都未完全迁移。随着体外成熟培养时间的延长，皮质颗粒完全迁移的卵母细胞比例显著增加(66.39%,20h;85.05%,24h)(P 0.05)。但是囊胚率除在体外培养26h时有小幅上升(P>0.05)外，随即就显著下降(P <0.05)。 6.结论：在山羊卵母细胞体外成熟培养时，采用COCs1枚/4μL培养液的培养密度，选用100-250μL范围内的培养液体积进行卵母细胞成熟培养;在体外培养的过程中，有腔卵泡（2-6mm）中的山羊卵母细胞具有恢复减数分裂的能力;在体外培养24h时，大部分山羊卵母细胞可以完成核成熟与胞质成熟;山羊卵母细胞成熟后会随着体外培养时间的延长而逐渐老化，尤其是体外培养时间超过24h以后，老化卵母细胞的比例显著增加，严重影响卵母细胞的发育能力。

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陕北白绒山羊鲜精细管输精技术研究与示范

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作者：杨万里西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，山羊生产也渐趋向于舍饲化、规模化和程序化。如何简单、高效地发挥山羊繁殖潜力，大批量生产商品羊已成为急需解决的重要问题。山羊鲜精细管输精技术，一种不需要专业的人工授精技术人员和输... 详细信息

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，山羊生产也渐趋向于舍饲化、规模化和程序化。如何简单、高效地发挥山羊繁殖潜力，大批量生产商品羊已成为急需解决的重要问题。山羊鲜精细管输精技术，一种不需要专业的人工授精技术人员和输精器械，且具有较高妊娠率新的人工授精方法。鲜精细管输精技术配合同期发情技术可以使适繁母羊在短时间内快速而高效地达到妊娠效果。本研究对陕北白绒山羊同期发情和鲜精细管输精技术进行了研究，初步建立了陕北白绒山羊原种场同期发情和人工授精技术体系。研究结果如下：（1）陕北白绒山羊精液稀释液的筛选。对采集的种公羊精液进行品质检查之后，将合格精液分别使用3种不同的精液稀释液稀释之后低温保存，每隔12h检测活力一次至精子全部死亡，统计精子存活指数和总存活时间。每个组进行3次独立重复试验。结果显示，配方1组的精子存活指数为57.6±6.05，总存活时间为118±6.93h，显著高于配方2组（40.68±2.29，90±0.00h）和配方3组的（47.44±5.06，103±14.00h）（P﹤0.05）。因此，本研究选择配方1为陕北白绒山羊精液稀释液。（2）陕北白绒山羊鲜精细管输精。采集种公羊精液，进行精液品质检查之后，将合格精液按实际需求进行适当比例稀释，分装到细管中对发情母羊进行人工授精，共配种母羊335只，间隔一个情期返情羊有62只，返情率为18.51%;细管输精受配母羊共有258只产羔，妊娠率为77.01%。与试验羊场近3年配种产羔情况相比，利用鲜精细管输精技术对陕北白绒山羊配种后，返情率降低，妊娠率升高。（3）陕北白绒山羊同期发情。在繁殖季节对55只育成陕北白绒山羊分三批使用间隔10d两次注射氯前列醇钠的方法进行同期发情，总发情率为94.54%，母羊一个情期的返情率为19.23%，返情羊补配后总妊娠率达到67.31%;对243只成年陕北白绒山羊使用羊用炔诺酮阴道栓配合肌肉注射促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH）的方法进行同期发情处理，有228只羊在撤栓之后的96h之内出现发情特征，同期发情率为93.8%，配种后间隔一个情期返情率为15.35%，返情羊补配后总妊娠率为82.89%;两种方法处理母羊后，发情时间都集中出现在处理之后的24~72h。因此可选择间隔10d两次注射氯前列醇钠的方法对育成陕北白绒山羊进行同期发情，使用阴道栓配合注射FSH的方法对成年陕北白绒山羊进行同期发情。

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雌激素膜受体介导雌激素对小鼠卵丘细胞中EGF样因子表达的调控及其机制的研究

雌激素膜受体介导雌激素对小鼠卵丘细胞中EGF样因子表达的调控及...

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作者：卢四海西北农林科技大学

学位级别：硕士

EGF(epidermal growth factor,EGF,表皮生长因子)样因子介导的信号网络在哺乳动物卵母细胞成熟过程中扮演着至关重要的作用。在卵母细胞发育后期,EGF信号在卵泡内的传导引发卵丘细胞扩展、间隙连接通讯关闭、卵母细胞减数分裂恢复和排... 详细信息

EGF(epidermal growth factor,EGF,表皮生长因子)样因子介导的信号网络在哺乳动物卵母细胞成熟过程中扮演着至关重要的作用。在卵母细胞发育后期,EGF信号在卵泡内的传导引发卵丘细胞扩展、间隙连接通讯关闭、卵母细胞减数分裂恢复和排卵等一系列生物学事件的发生。研究发现,在卵母细胞体外成熟培养体系中17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E,以下全文用E表示)有助于间隙连接通讯关闭、卵丘细胞扩展和卵母细胞减数分裂恢复,但雌激素在这一过程中发挥作用的分子机制尚不明确。本研究通过检测小鼠卵泡和卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex,COCs)中G蛋白偶联雌激素受体1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1,也被称为雌激素膜受体)的表达和定位,研究E能否通过激活GPER1诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子表达,以及E诱导小鼠卵丘细胞EGF样因子表达的机制。研究内容和结果如下:(1)应用免疫荧光染色、反转录PCR(RT-PCR)技术和Western blot技术检测GPER1在小鼠卵泡和COCs中的定位和表达。免疫荧光染色结果表明,GPER1定位于颗粒细胞,卵丘细胞和卵母细胞中。RT-PCR和Western blot结果表明,GPER1m RNA和蛋白在小鼠卵丘细胞和卵母细胞中均有表达。(2)应用ELISA和Western blot技术检测GPER1被激活后小鼠卵丘细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和c AMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平的变化。1μΜE或1μΜG1(GPER1激动剂)分别对COCs处理不同时间,检测卵丘细胞内c AMP和CREB磷酸化水平的变化,同时设GPER1抑制剂G15处理组、雌激素核受体抑制剂ICI182780处理组和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)特异性抑制剂H89处理组。结果显示,用1μΜE或1μΜG1处理COCs后,卵丘细胞中c AMP水平迅速升高,在处理45 min达到峰值;而G15和H89均抑制了E对小鼠卵丘细胞中c AMP水平上调的作用,ICI182780处理未表现出对E作用的影响。与此结果相一致,1μΜE或1μΜG1对COCs处理45 min和1 h,卵丘细胞中CREB磷酸化水平显著提高,且G15而非ICI182780抑制了E对小鼠卵丘细胞中CREB磷酸化水平上调的作用。另外,我们发现H89同样抑制了E对小鼠卵丘细胞中CREB磷酸化水平上调的作用。这些研究结果说明,E通过GPER1诱导小鼠卵丘细胞中c AMP水平升高,且PKA介导了E诱导的小鼠卵丘细胞中c AMP依赖性CREB的磷酸化。(3)在卵泡发育过程中,c AMP依赖性CREB的激活能诱导颗粒细胞中EGF样因子的转录表达。我们应用q RT-PCR技术检测小鼠卵丘细胞中EGF样因子(Areg,Ereg,Btc)m RNA的相对表达量。结果显示,1μΜE或1μM G1分别处理1 h均能显著上调小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA表达,G15和H89均表现出对E上调小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA表达的抑制作用,而ICI182780处理未表现出对E作用的影响。这些研究结果说明,E通过GPER1/c AMP/PKA/CREB信号通路诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA的表达。(4)为了进一步探究GPER1在E诱导的卵丘细胞EGF样因子表达中的作用,我们对分离的小鼠卵丘细胞进行体外培养,采用GPER1 si RNA技术干扰卵丘细胞GPER1表达,并检测干扰GPER1表达的卵丘细胞中E和G1诱导的EGF样因子m RNA表达变化。结果表明,卵丘细胞中GPER1表达被干扰后,E和G1均不能诱导卵丘细胞EGF样因子m RNA表达上调。这一研究结果进一步说明,GPER1介导了E诱导的小鼠卵丘细胞中EGF样因子的表达。综上,E通过c AMP/PKA/CREB信号通路诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子的表达,并且这一生物学效应由GPER1介导。

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后备奶牛专业化饲养技术应用试验

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作者：刘卿西北农林科技大学

学位级别：硕士

我国传统的奶牛混群饲养模式往往导致奶牛群中后备牛生长发育整体水平下降,使育成牛转群质量下降、奶牛群整体后劲不足,直接影响奶牛生产性能的充分发挥、原料奶产量和质量,进而影响整个牛场的经济效益。从我国奶牛饲养的现状、特点、... 详细信息

我国传统的奶牛混群饲养模式往往导致奶牛群中后备牛生长发育整体水平下降,使育成牛转群质量下降、奶牛群整体后劲不足,直接影响奶牛生产性能的充分发挥、原料奶产量和质量,进而影响整个牛场的经济效益。从我国奶牛饲养的现状、特点、存在的主要问题及面临的发展机遇出发,借鉴国外经验,利用现有奶牛饲养技术优势,提出后备奶牛场专业化饲养的奶牛饲养管理模式。后备牛专业化饲养以成立后备奶牛饲养场为依托,以推广和开发先进的、成熟的饲养技术为主要内容,把饲养的科学技术和管理经营的科学技术有机地结合一起,改变传统的混合群奶牛场的模式。以建立专业化后备牛饲养场为基础,推行TMR饲养技术和信息化网络管理技术,并实行犊牛分群饲养管理技术、犊牛提前断奶技术和育成牛提前配种技术等专业化、集约化饲养模式。同时在后备牛生长发育阶段,根据犊牛出生后不同阶段生长发育营养需要与管理需要,制定不同的营养标准和饲养规范,分阶段采取不同的饲养技术。尽量用最小成本,最大限度地挖掘牛的生长发育潜能。最终达到犊牛提前断奶和育成牛提早配种的目的。研究与应用结果表明,在后备牛专业化饲养模式下,通过采取新生犊牛及时饲喂初乳、提早训练犊牛采食精饲料和优质粗饲料、犊牛分群精心饲养管理等一系列饲养管理措施,在犊牛出生45～50d、犊牛能采食精料量达到1 kg时即可进行早期断奶。哺乳期全期哺育量250 kg,比传统饲养的400 kg节约了150 kg;日增重由传统的700g/d提高到910g/d。由于后备牛的生长发育速度提高,在出生后13.5月龄时,育成牛已达到了体重380 kg,体高130 cm,体长142 cm等初配牛的体重和体尺要求,比传统的15月龄提前了45天。提早配种的育成牛首次配种情期受胎率66.8%,总受胎率97.2%。实施后备牛专业化饲养的奶牛场,已完成胎次产奶(305 d)的348头初产牛平均产奶量为7 328 kg,比传统饲养条件下的6 752 kg增加576 kg。在取得上述技术成果的同时,后备牛专业化饲养模式的应用,取得了较大的经济效益。在项目研究与应用的两年间,实施犊牛早期断奶技术,全场节约牛奶消耗资金36.72万元;由于配种月龄的提前,全场两年节约资金36.72万元;由于首次配种月龄由的提前,转群成本由传统饲养的7523元降低到6498元,两年间共提前转群1176头,节约转群成本120.54万元;已完成胎次产奶的348头初产牛产奶量增加的新增效益40.0896万元;实施后备牛专业化饲养技术后,从提高劳动生产力的效益、减少疾病发生和节约饲料等方面,共取得经济效益71.574万元。项目研究实施期间实现经济效益268.92万元。本研究建立了后备牛专业化饲养的养殖模式,该模式的研究实施,使受试牛群犊牛断奶时间提前、育成牛配种时间提前,降低了转群成本和饲养管理费用,提高了奶牛场牛群整体水平与生产管理技术水平,并可使后备牛专业化饲养场的效益明显增加。

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雌激素膜受体GPR30在山羊卵丘卵母细胞复合体间隙连接通讯中的作用及其机制研究

雌激素膜受体GPR30在山羊卵丘卵母细胞复合体间隙连接通讯中的作...

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作者：张辉西北农林科技大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵泡主要由卵泡体细胞和生殖细胞组成,颗粒细胞间、卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间存在着间隙连接(gap junction),从而形成了一个功能性合胞体。卵泡发育过程中,卵母细胞周围出现透明带,卵丘细胞与卵母细胞膜间形成跨带突触(... 详细信息

哺乳动物卵泡主要由卵泡体细胞和生殖细胞组成,颗粒细胞间、卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间存在着间隙连接(gap junction),从而形成了一个功能性合胞体。卵泡发育过程中,卵母细胞周围出现透明带,卵丘细胞与卵母细胞膜间形成跨带突触(transzonal cytoplasmic projections,TZPs),形似丝状伪足,其末端也形成间隙连接;间隙连接为卵母细胞发育输送大量信号物质和能量,也在卵母细胞成熟调控和排卵过程中发挥重要作用。在卵母细胞自发成熟或促性腺激素诱导的卵母细胞成熟过程中,都伴随着卵泡颗粒细胞间隙连接的减少,卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接则逐渐关闭甚至消失。研究发现,促黄体素(luteinizing hormone,LH)可作用于颗粒细胞的隙连接,终止cGMP等减数分裂抑制物质的传输,诱导卵母细胞恢复减数分裂。雌激素在卵泡发育过程中也能调节间隙连接相关蛋白的表达,但雌激素调控卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex,COCs)间隙连接通讯功能和相关机制尚不明确。本研究通过检测山羊COCs体外成熟培养过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的发生,研究17β-雌二醇(17β-E)对GVBD发生的调节及其作用通路,以及TZPs数量和间隙连接通讯动态变化在卵母细胞核成熟过程中的作用,探讨雌激素对山羊COCs间隙连接通讯和卵母细胞核成熟进程的影响,揭示间隙连接在卵母细胞成熟过程中的功能状态及其调控机制。研究内容和结果如下:(1)采用Hoechst33342对山羊卵母细胞核染色后,进行染色质形态观察,检测17β-E在山羊COCs体外培养过程中的作用。山羊COCs在基础培养液或添加1μg/mL17β-E处理,体外培养2,4,6 h和8 h,结果表明在17β-E处理到4 h和6 h时,卵母细胞GVBD发生率显著高于不添加17β-E的对照组;进一步采用雌激素核受体(estrogen recepter,ER)抑制剂ICI182780,雌激素膜受体(G protein coupled receptor30,GPR30)抑制剂G15或激动剂G1,研究雌激素促进山羊卵母细胞核成熟进程的受体通路,结果表明,17β-E促进山羊卵母细胞GVBD的发生的作用能被雌激素膜受体GPR30激动剂G1模仿,而能被GPR30抑制剂G15所抑制;核受体抑制剂ICI182780却不能抑制17β-E对山羊卵母细胞GVBD发生的促进作用。说明,在山羊COCs体外培养过程中,1μg/mL 17β-E能够促进卵母细胞提前发生GVBD,这种促进作用是由其膜受体GPR30介导的。(2)卵母细胞核成熟进程中,TZPs数量和间隙连接通讯功能均会发生动态变化,但这些动态变化是否受雌激素及其受体通路调控,需要进一步验证。利用免疫荧光技术,检测新鲜分离、成熟培养前山羊COCs中GPR30和间隙连接蛋白CX43的表达与定位,结果表明成熟培养前山羊COCs的卵丘细胞和卵母细胞均存在GPR30和CX43表达,并定位于细胞膜上。为了验证TZPs在17β-E促进山羊卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在COCs体外培养体系中添加或不添加17β-E,分别在COCs体外培养的0,6,24 h检测卵丘细胞和卵母细胞间TZPs的表达数量,发现在体外培养6h和24 h时,所有COCs卵丘细胞和卵母细胞之间TZPs数量均显著下降(P<0.05),其中体外培养6 h时17β-E处理组与不添加17β-E的对照组相比没有明显差异,而培养24 h时17β-E处理组TZPs表达数量与对照组相比显著下降(P<0.05),提示17β-E并不是通过影响COCs中TZPs的表达而调控卵母细胞核成熟进程。为了进一步验证间隙连接在17β-E促进卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在添加1μg/mL 17β-E的培养体系中培养山羊COCs,在培养前及培养到2,4,6,8 h时,采用显微操作系统分别将荧光黄(lucifer yellow,LY)注入到卵母细胞胞质中,根据荧光黄从卵母细胞向卵丘细胞的扩散程度,监测不同培养时间COCs的间隙连接通讯功能,结果显示从卵泡新鲜分离的山羊COCs间隙连接有87.5%处于开放状态,17β-E处理4h和6h间隙连接通讯明显下调(P<0.05);向COCs培养体系中分别添加1μg/mL 17β-E或雌激素膜受体激动剂G1,或联合添加17β-E和雌激素膜受体抑制剂,或联合添加17β-E和雌激素核受体抑制剂ICI182780,在COCs体外培养的4 h,将COCs转移到含钙黄绿素乙酰甲基酯(Calcein-AM)的磷酸盐缓冲液中,监测钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移情况,检测雌激素受体通路对间隙连接通讯活

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Wnt信号通路激活剂BIO在山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构中的调控作用

Wnt信号通路激活剂BIO在山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构中的调控...

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作者：孟凯西北农林科技大学

学位级别：硕士

乳腺是一种复杂的分泌器官,它的主要功能是泌乳。其中乳腺导管和小叶腺泡是乳腺执行泌乳过程所必须的,乳腺导管主要参与乳汁的运输而乳腺腺泡则具有泌乳功能。所以对乳腺上皮细胞构成乳腺导管结构和乳腺腺泡结构的机制的研究是非常重要... 详细信息

乳腺是一种复杂的分泌器官,它的主要功能是泌乳。其中乳腺导管和小叶腺泡是乳腺执行泌乳过程所必须的,乳腺导管主要参与乳汁的运输而乳腺腺泡则具有泌乳功能。所以对乳腺上皮细胞构成乳腺导管结构和乳腺腺泡结构的机制的研究是非常重要的。在体试验中Wnt信号通路在乳腺腺泡发育和乳腺导管发育方面的作用机制已经被广泛研究,并且取得了很大的进展。由于在体试验中乳腺发育中调控因素较多,它们会对研究Wnt信号通路在乳腺上皮细胞形成腺泡样结构中的调控作用有影响。因此,在体外条件下研究Wnt信号通路对乳腺上皮细胞分化与功能的影响是非常有意义的。为了研究体外条件下Wnt信号通路对乳腺上皮细胞分化与功能的影响,本研究使用关中奶山羊的乳腺上皮细胞作为试验材料,在二维和三维的培养条件下研究Wnt信号通路激活剂BIO对山羊乳腺上皮细胞生物学特性以及发育能力的影响。研究结果如下:1.通过组织块法和差速消化法分离、纯化得到具有酪蛋白和乙酰辅酶A羧化酶mRNA表达的山羊乳腺上皮细胞。在二维培养条件下,Wnt信号通路激活剂BIO可促进山羊乳腺上皮细胞形成能够表达酪蛋白和乙酰辅酶A羧化酶mRNA的腺泡样结构;在三维培养条件下,BIO可以促进山羊乳腺上皮细胞形成能表达酪蛋白和乙酰辅酶A羧化酶的mRNA的乳腺腺泡样结构和导管样结构;与常规三维培养相比,在添加BIO的培养液中培养的腺泡结构体积更大,并且成腔速度更快。2.通过单细胞克隆培养法分离得到了能表达酪蛋白和乙酰辅酶A羧化酶mRNA的两种增殖特性的山羊乳腺上皮细胞,即扁平状增殖的乳腺上皮细胞和蜂窝状增殖的乳腺上皮细胞。在二维培养条件下对两种增殖特性的山羊乳腺上皮细胞的生物学特性、形态结构和特异性基因表达功能进行了研究,其中扁平状增殖的乳腺上皮细胞高表达N-钙粘素,并且具有雌激素受体α、雌激素受体β和孕酮受体mRNA的表达能力;蜂窝状增殖的乳腺上皮细胞仅能表达雌激素受体β。在三维培养条件下,蜂窝状增殖的乳腺上皮细胞较扁平状增殖的乳腺上皮细胞所能形成的腺泡样结构数量更多,体积更大。3.在二维培养条件下,Wnt信号通路激活剂BIO可以促进蜂窝状增殖的山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构,但不能促进扁平状增殖的山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构。在三维培养条件下,BIO可促进蜂窝状增殖的山羊乳腺上皮细胞形成有功能的腺泡样结构和导管样结构;而扁平状增殖的山羊乳腺上皮细胞所形成的腺泡样结构数量较少,体积较小。

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牛体外受精技术体系的优化研究

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作者：胡林勇西北农林科技大学

学位级别：硕士

自1982年第一头牛体外受精后代出生以来,虽然国内外学者对牛的体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术进行了不断的完善,但是目前对于一些因素对IVF效率的影响还存争议。因此,有必要对牛的IVF体系进行优化研究。这不仅有助于进一步... 详细信息

自1982年第一头牛体外受精后代出生以来,虽然国内外学者对牛的体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术进行了不断的完善,但是目前对于一些因素对IVF效率的影响还存争议。因此,有必要对牛的IVF体系进行优化研究。这不仅有助于进一步明确这些因素对IVF的影响,而且对于提高IVF胚胎生产效率及加速IVF技术在生产上的推广应用都有重要的意义。本研究在目前国内外体外受精研究的基础上,对牛卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)、IVF及早期胚胎的体外培养(in vitro culture,IVC)作了进一步的优化研究,并重点研究了葡萄糖对牛IVF及早期胚胎体外培养的影响。旨在建立一套经过优化的牛IVF技术体系。 1.在卵母细胞体外培养中,比较了不同蛋白质添加物(胎牛血清,fetal bovine serum,FBS;新生牛血清,newborn calf serum,NCS;牛血清白蛋白,bovine serum albumin,BSA)以及表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对卵母细胞IVM的影响。结果表明,与BSA相比,血清可以显著促进卵母细胞的成熟,而FBS对成熟效果要好于NCS。EGF添加量在20 ng/mL时即明显促进卵母细胞的成熟率,随着其浓度的增加,卵母细胞成熟率并未相应增加。 2.在精子获能和受精中,不同公牛个体对体外受精卵裂率、8-细胞胚胎发育率及囊胚率均有明显影响,就体外受精卵裂率来讲,2号牛(62.3%)和3号牛(67.4%)显著高于5号牛(35.8%, P0.05),这提示葡萄糖对胚胎发育的影响与其添加时期有关。在以FBS为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖与否并未显著影响IVF胚胎的囊胚发育率;而在以BSA为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖却明显促进了IVF胚胎的囊胚发育率(23.1% vs. 17.3%, P<0.05)。这说明葡萄糖对IVF胚胎体外发育的影响还与蛋白质添加物有关。另外,在培养液中添加1.5 mmol/L葡萄糖时,以FBS为蛋白质添加物组的囊胚发育率显著高于以BSA作为蛋白质添加物组(37.8% vs 23.1%,P<0.05)。这进一步说明FBS可以提高牛IVF体系的胚胎生产效率,在牛IVF体系中具有重要作用。

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小鼠发情周期卵泡发育、生长因子与促进腺激素受体表达规律及超数排卵研究

小鼠发情周期卵泡发育、生长因子与促进腺激素受体表达规律及超数...

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作者：朱娜西北农林科技大学

学位级别：硕士

本试验以获得高效超排效果为主要目的，研究发情周期对小鼠超排的影响，探索处于发情周期不同阶段动物的卵巢发育机制，明确卵泡刺激素受体（follicle-stimulatinghormone receptor，FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone recep... 详细信息

本试验以获得高效超排效果为主要目的，研究发情周期对小鼠超排的影响，探索处于发情周期不同阶段动物的卵巢发育机制，明确卵泡刺激素受体（follicle-stimulatinghormone receptor，FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和胰岛样生长因子Ⅰ受体（insulin-like growth factor-Ⅰreceptor，IGF-ⅠR）在发情周期不同阶段小鼠卵巢组织中的定位及表达规律，以掌握卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及胰岛样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）对小鼠卵泡发育的调控作用，将其应用于超排可对超排效果起到辅助促进作用。以上述研究为基础，根据试验需要调整超排起始时间和超排小鼠排卵、受精及胚胎发育的时程，以满足研究工作者对不同成熟阶段卵母细胞、不同发育阶段受精卵和早期胚胎的需求。1．选用雌性昆明系小鼠，采用阴门状态观察、阴道脱落细胞涂片制作的方法判断小鼠发情周期阶段，并采用卵巢组织切片法观察小鼠发情周期卵泡发育动态。在此基础上，对处于不同发情周期阶段的小鼠进行超排处理，追踪超排后卵泡发育情况和胚胎回收结果，确定超排开始的适宜发情周期阶段。结果表明，小鼠发情周期中，其阴门状态、阴道脱落细胞种类及卵泡发育动态之间存在相关关系。处于发情前期小鼠的超排效果优于其他3组。2．采用免疫组织化学染色法，研究FSHR、LHR、EGFR、IGF-ⅠR于发情周期不同阶段小鼠卵巢中的分布与表达规律。选取处于间情期和发情期的小鼠，根据体重对其进行EGF溶液的腹腔注射并超排配种，注射浓度分别为0ng/g、5ng/g、10ng/g、20ng/g。追踪超排后的卵泡发育状况和胚胎回收结果。结果表明，FSH、LH主要作用于有腔卵泡，EGF、IGF-Ⅰ主要作用于腔前卵泡。浓度为5ng/g、10ng/g、20ng/g的EGF腹腔注射对间情期和发情前期小鼠的卵巢发育及超排效果均有促进作用。3．对处于发情前期的昆白系小鼠进行超排，分别以12：00、16：00、20：00为起始时间注射PMSG，明确其排卵、受精及早期胚胎发育时程。结果表明，以16：00组为起始时间超排小鼠，其排卵、受精和胚胎发育时程相对稳定，规律性最为显著，超排效果较为理想。以20：00为起始时间超排小鼠，排卵及胚胎各阶段发育的时间相对16：00推后3～4个小时，胚胎发育规律较为稳定。以12：00为起始时间超排小鼠，其排卵及胚胎各阶段发育的时间相对于16：00提前3～4个小时，但胚胎发育规律的稳定性较其他两组不理想。综上所述，阴门状态观察法与阴道脱落细胞涂片法均可用于小鼠发情周期阶段的判断，而发情前期小鼠超排效果最佳。生长因子EGF、IGF-Ⅰ对腔前卵泡的发育起主导作用，而促性腺激素FSH、LH主要调控有腔卵泡的发育。于不同始时间超排小鼠，其排卵、受精及早期胚胎发育时程呈明显的规律性，这为小鼠胚胎工程的后续研究工作提供了参考依据。

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