雌激素膜受体GPR30在山羊卵丘卵母细胞复合体间隙连接通讯中的作用及其机制研究
作者单位：西北农林科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：马保华
授予年度：2018年
主 题：雌激素 雌激素膜受体GPR30 山羊 卵丘卵母细胞复合体 间隙连接通讯
摘 要：哺乳动物卵泡主要由卵泡体细胞和生殖细胞组成,颗粒细胞间、卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间存在着间隙连接(gap junction),从而形成了一个功能性合胞体。卵泡发育过程中,卵母细胞周围出现透明带,卵丘细胞与卵母细胞膜间形成跨带突触(transzonal cytoplasmic projections,TZPs),形似丝状伪足,其末端也形成间隙连接;间隙连接为卵母细胞发育输送大量信号物质和能量,也在卵母细胞成熟调控和排卵过程中发挥重要作用。在卵母细胞自发成熟或促性腺激素诱导的卵母细胞成熟过程中,都伴随着卵泡颗粒细胞间隙连接的减少,卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接则逐渐关闭甚至消失。研究发现,促黄体素(luteinizing hormone,LH)可作用于颗粒细胞的隙连接,终止cGMP等减数分裂抑制物质的传输,诱导卵母细胞恢复减数分裂。雌激素在卵泡发育过程中也能调节间隙连接相关蛋白的表达,但雌激素调控卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex,COCs)间隙连接通讯功能和相关机制尚不明确。本研究通过检测山羊COCs体外成熟培养过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的发生,研究17β-雌二醇(17β-E)对GVBD发生的调节及其作用通路,以及TZPs数量和间隙连接通讯动态变化在卵母细胞核成熟过程中的作用,探讨雌激素对山羊COCs间隙连接通讯和卵母细胞核成熟进程的影响,揭示间隙连接在卵母细胞成熟过程中的功能状态及其调控机制。研究内容和结果如下:(1)采用Hoechst33342对山羊卵母细胞核染色后,进行染色质形态观察,检测17β-E在山羊COCs体外培养过程中的作用。山羊COCs在基础培养液或添加1μg/mL17β-E处理,体外培养2,4,6 h和8 h,结果表明在17β-E处理到4 h和6 h时,卵母细胞GVBD发生率显著高于不添加17β-E的对照组;进一步采用雌激素核受体(estrogen recepter,ER)抑制剂ICI182780,雌激素膜受体(G protein coupled receptor30,GPR30)抑制剂G15或激动剂G1,研究雌激素促进山羊卵母细胞核成熟进程的受体通路,结果表明,17β-E促进山羊卵母细胞GVBD的发生的作用能被雌激素膜受体GPR30激动剂G1模仿,而能被GPR30抑制剂G15所抑制;核受体抑制剂ICI182780却不能抑制17β-E对山羊卵母细胞GVBD发生的促进作用。说明,在山羊COCs体外培养过程中,1μg/mL 17β-E能够促进卵母细胞提前发生GVBD,这种促进作用是由其膜受体GPR30介导的。(2)卵母细胞核成熟进程中,TZPs数量和间隙连接通讯功能均会发生动态变化,但这些动态变化是否受雌激素及其受体通路调控,需要进一步验证。利用免疫荧光技术,检测新鲜分离、成熟培养前山羊COCs中GPR30和间隙连接蛋白CX43的表达与定位,结果表明成熟培养前山羊COCs的卵丘细胞和卵母细胞均存在GPR30和CX43表达,并定位于细胞膜上。为了验证TZPs在17β-E促进山羊卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在COCs体外培养体系中添加或不添加17β-E,分别在COCs体外培养的0,6,24 h检测卵丘细胞和卵母细胞间TZPs的表达数量,发现在体外培养6h和24 h时,所有COCs卵丘细胞和卵母细胞之间TZPs数量均显著下降(P0.05),其中体外培养6 h时17β-E处理组与不添加17β-E的对照组相比没有明显差异,而培养24 h时17β-E处理组TZPs表达数量与对照组相比显著下降(P0.05),提示17β-E并不是通过影响COCs中TZPs的表达而调控卵母细胞核成熟进程。为了进一步验证间隙连接在17β-E促进卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在添加1μg/mL 17β-E的培养体系中培养山羊COCs,在培养前及培养到2,4,6,8 h时,采用显微操作系统分别将荧光黄(lucifer yellow,LY)注入到卵母细胞胞质中,根据荧光黄从卵母细胞向卵丘细胞的扩散程度,监测不同培养时间COCs的间隙连接通讯功能,结果显示从卵泡新鲜分离的山羊COCs间隙连接有87.5%处于开放状态,17β-E处理4h和6h间隙连接通讯明显下调(P0.05);向COCs培养体系中分别添加1μg/mL 17β-E或雌激素膜受体激动剂G1,或联合添加17β-E和雌激素膜受体抑制剂,或联合添加17β-E和雌激素核受体抑制剂ICI182780,在COCs体外培养的4 h,将COCs转移到含钙黄绿素乙酰甲基酯(Calcein-AM)的磷酸盐缓冲液中,监测钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移情况,检测雌激素受体通路对间隙连接通讯活
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