雌激素膜受体介导雌激素对小鼠卵丘细胞中EGF样因子表达的调控及其机制的研究

作     者：卢四海 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马保华

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 0836[工学-生物工程] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：G蛋白偶联雌激素受体1 环磷酸腺苷 cAMP反应元件结合蛋白 表皮生长因子样因子 

摘      要：EGF(epidermal growth factor,EGF,表皮生长因子)样因子介导的信号网络在哺乳动物卵母细胞成熟过程中扮演着至关重要的作用。在卵母细胞发育后期,EGF信号在卵泡内的传导引发卵丘细胞扩展、间隙连接通讯关闭、卵母细胞减数分裂恢复和排卵等一系列生物学事件的发生。研究发现,在卵母细胞体外成熟培养体系中17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E,以下全文用E表示)有助于间隙连接通讯关闭、卵丘细胞扩展和卵母细胞减数分裂恢复,但雌激素在这一过程中发挥作用的分子机制尚不明确。本研究通过检测小鼠卵泡和卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex,COCs)中G蛋白偶联雌激素受体1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1,也被称为雌激素膜受体)的表达和定位,研究E能否通过激活GPER1诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子表达,以及E诱导小鼠卵丘细胞EGF样因子表达的机制。研究内容和结果如下:(1)应用免疫荧光染色、反转录PCR(RT-PCR)技术和Western blot技术检测GPER1在小鼠卵泡和COCs中的定位和表达。免疫荧光染色结果表明,GPER1定位于颗粒细胞,卵丘细胞和卵母细胞中。RT-PCR和Western blot结果表明,GPER1m RNA和蛋白在小鼠卵丘细胞和卵母细胞中均有表达。(2)应用ELISA和Western blot技术检测GPER1被激活后小鼠卵丘细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和c AMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平的变化。1μΜE或1μΜG1(GPER1激动剂)分别对COCs处理不同时间,检测卵丘细胞内c AMP和CREB磷酸化水平的变化,同时设GPER1抑制剂G15处理组、雌激素核受体抑制剂ICI182780处理组和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)特异性抑制剂H89处理组。结果显示,用1μΜE或1μΜG1处理COCs后,卵丘细胞中c AMP水平迅速升高,在处理45 min达到峰值;而G15和H89均抑制了E对小鼠卵丘细胞中c AMP水平上调的作用,ICI182780处理未表现出对E作用的影响。与此结果相一致,1μΜE或1μΜG1对COCs处理45 min和1 h,卵丘细胞中CREB磷酸化水平显著提高,且G15而非ICI182780抑制了E对小鼠卵丘细胞中CREB磷酸化水平上调的作用。另外,我们发现H89同样抑制了E对小鼠卵丘细胞中CREB磷酸化水平上调的作用。这些研究结果说明,E通过GPER1诱导小鼠卵丘细胞中c AMP水平升高,且PKA介导了E诱导的小鼠卵丘细胞中c AMP依赖性CREB的磷酸化。(3)在卵泡发育过程中,c AMP依赖性CREB的激活能诱导颗粒细胞中EGF样因子的转录表达。我们应用q RT-PCR技术检测小鼠卵丘细胞中EGF样因子(Areg,Ereg,Btc)m RNA的相对表达量。结果显示,1μΜE或1μM G1分别处理1 h均能显著上调小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA表达,G15和H89均表现出对E上调小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA表达的抑制作用,而ICI182780处理未表现出对E作用的影响。这些研究结果说明,E通过GPER1/c AMP/PKA/CREB信号通路诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子m RNA的表达。(4)为了进一步探究GPER1在E诱导的卵丘细胞EGF样因子表达中的作用,我们对分离的小鼠卵丘细胞进行体外培养,采用GPER1 si RNA技术干扰卵丘细胞GPER1表达,并检测干扰GPER1表达的卵丘细胞中E和G1诱导的EGF样因子m RNA表达变化。结果表明,卵丘细胞中GPER1表达被干扰后,E和G1均不能诱导卵丘细胞EGF样因子m RNA表达上调。这一研究结果进一步说明,GPER1介导了E诱导的小鼠卵丘细胞中EGF样因子的表达。综上,E通过c AMP/PKA/CREB信号通路诱导小鼠卵丘细胞中EGF样因子的表达,并且这一生物学效应由GPER1介导。