检索结果-南通市图书馆

作者：申振花西南民族大学

学位级别：硕士

普通牛与牦牛的杂交后代称为犏牛,在杂交后代中母犏牛具有正常繁殖能力,但F1～F3代公犏牛都不具有生育能力,无法产生精子。迄今为止,有关犏牛雄性不育的分子机制还没有明确的结论。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶（KDMs）可能影响组蛋白... 详细信息

普通牛与牦牛的杂交后代称为犏牛,在杂交后代中母犏牛具有正常繁殖能力,但F1～F3代公犏牛都不具有生育能力,无法产生精子。迄今为止,有关犏牛雄性不育的分子机制还没有明确的结论。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶（KDMs）可能影响组蛋白的甲基化水平,而在精子发生过程中发挥重要作用。本研究的目的是探讨KDMs家族中的KDM1A和KDM4B两种去甲基化酶在犏牛雄性不育中的可能作用。实验材料为性成熟的成年牦牛（n=10）和杂交一代犏牛（n=10）。将性成熟的牦牛和犏牛附睾制成石蜡切片,经染色后在显微镜下观察附睾的组织结构;从睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了KDM1A和KDM4B的编码序列（CDS）,并分别用定量PCR和Western blotting检测牦牛和犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B的m RNA和蛋白水平;利用ELISA方法比较了牦牛和犏牛睾丸中H3K36me3和H3K27me3的组蛋白甲基化修饰水平。本研究获得的主要结果如下:（1）牦牛和犏牛附睾切片在镜下观察,在牦牛附睾管中存在大量精子,而犏牛附睾管中不存在精子。（2）牦牛睾丸KDM1A的测序结果显示两个剪接体,与普通牛类似,其中KDM1A剪接体1的CDS为2622 bp,编码873个氨基酸,而剪接体2的CDS为2562 bp,编码853个氨基酸。与剪接体1相比,剪接体2缺失一段60 bp长度的片段,其余序列相同。与普通牛KDM1A基因两种剪接体相比,牦牛KDM1A基因两种剪接体在CDS中均有5个核苷酸差异,但对应的氨基酸序列完全一致。KDM1A基因剪接体1的CDS与普通牛（99.81%）、野牦牛（99.50%）、羊（97.75%）、猪（93.77%）、狗（93.29%）、马（93.60%）等6种动物KDM1A基因有93.29%～99.81%的序列一致性。KDM4B基因的CDS长度为3351 bp,编码1116个氨基酸。与普通牛相比,牦牛KDM4B序列中间缺少一个25个氨基酸的片段,有28个核苷酸差异,并导致9个氨基酸不同。KDM4B基因序列与普通牛（99.07%）、野牦牛（97.94%）、羊（96.84%）、猪（90.95%）、狗（88.46%）、马（87.74%）等6种动物具有87.74%～99.07%的序列一致性。这些结果说明牦牛KDM1A和KDM4B基因均较保守。（3）采用实时定量PCR方法检测牦牛和犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B的m RNA水平。结果表明,与牦牛相比,犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B基因的相对m RNA水平均极显著降低（P＜0.01）。采用Western blotting检测KDM1A和KDM4B蛋白在牦牛和犏牛睾丸中的表达,结果显示,两种蛋白在犏牛睾丸中的表达也极显著低于在牦牛睾丸中的表达（P＜0.01）。（4）ELISA结果显示,与牦牛相比,犏牛睾丸中H3K36me3的水平显著降低（P＜0.05）,但H3K27me3的水平没有显著差异。以上结果表明在犏牛精子发生过程中,精子发生可能受到了KDM1A的m RNA和蛋白水平以及组蛋白H3K36三甲基化水平的影响。本研究结果为进一步从表观遗传学角度解释犏牛雄性不育的分子机制提供了新的资料。

关键词：表观遗传犏牛雄性不育 KDM1A KDM4B H3K36me3

藏系绵羊MSX2基因皮肤特异表达载体构建及功能分析

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藏系绵羊MSX2基因皮肤特异表达载体构建及功能分析

作者：付伟西南民族大学

学位级别：硕士

本研究对藏系绵羊同源异型基因家族成员MSX2基因的序列、组织表达谱及其对细胞内信号分子表达的影响进行分析,为进一步研究MSX2基因对藏系绵羊毛囊发育等过程的影响奠定基础。试验采集了母藏系绵羊(n=5)的心、肝、脾、肺、肾、皮肤和脂... 详细信息

本研究对藏系绵羊同源异型基因家族成员MSX2基因的序列、组织表达谱及其对细胞内信号分子表达的影响进行分析,为进一步研究MSX2基因对藏系绵羊毛囊发育等过程的影响奠定基础。试验采集了母藏系绵羊(n=5)的心、肝、脾、肺、肾、皮肤和脂肪等组织,从皮肤中克隆了MSX2基因编码区序列,并分析了其在不同组织的表达;构建了该基因的皮肤特异表达载体,并转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(Human hair inner root sheath cells,HHIRSC),再利用荧光定量PCR及Western blot技术检测该基因下游靶基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。本研究获得的主要结果如下:1、克隆得到藏系绵羊MSX2基因编码区序列,长度为804 bp。与预测的绵羊MSX2基因序列相比,编码区有6个差异碱基,匹配序列相似性为99.25%,另外还有6个碱基缺失。藏系绵羊MSX2基因推导的氨基酸序列包含267个氨基酸,理论分子量为28.98 kD,预测的理论等电点与普通绵羊相同,均为10.32,但存在3个氨基酸差异,并缺失了连续2个氨基酸,序列相似性为98.88%。2、利用荧光定量PCR分析了MSX2基因在藏系绵羊心、肝、脾、肺、肾、皮肤和脂肪的表达情况。结果显示,皮肤中MSX2基因的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),暗示MSX2基因可能与藏系绵羊毛发生长或性状相关。3、以pCDsRed2-1真核载体为骨架,构建了含KAP6.1皮肤特异启动子的MSX2基因皮肤特异表达载体pCDsR-KM。将该真核表达载体瞬时转染进入人毛囊内根鞘细胞,转染效率为10%左右;用流式细胞术分选转染成功的细胞,获得了转染MSX2基因的HHIRSC。4、荧光定量PCR检测表明,在流式细胞仪筛选后的HHIRSC中,MSX2基因超表达约9000倍,而MSX2基因下游靶基因Lef1、Foxn1、Notch1和Notch2基因的mRNA水平均显著上调。进一步用Western blot检测Notch1和Notch2蛋白的表达情况,证实这两种蛋白质的表达量亦显著上调。这些结果提示,MSX2基因有可能通过Wnt、Notch和MSX2/Foxn1/毛发角蛋白等信号通路,影响皮肤毛囊发生和周期性变化。

关键词：藏系绵羊 MSX2基因皮肤特异表达载体毛囊

牦牛肌红蛋白的基因克隆、分离纯化及其与能量代谢关系的初步研究

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牦牛肌红蛋白的基因克隆、分离纯化及其与能量代谢关系的初步研究

作者：苏永杰西南民族大学

学位级别：硕士

为探索牦牛适应青藏高原特殊缺氧环境的分子机制,对牦牛肌红蛋白开展了三个方面的研究:牦牛肌红蛋白基因的克隆;牦牛肌红蛋白的分离纯化;牦牛、水牛、黄牛心肌和骨骼肌肌红蛋白含量的测定及其与乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活力的关系。1.... 详细信息

为探索牦牛适应青藏高原特殊缺氧环境的分子机制,对牦牛肌红蛋白开展了三个方面的研究:牦牛肌红蛋白基因的克隆;牦牛肌红蛋白的分离纯化;牦牛、水牛、黄牛心肌和骨骼肌肌红蛋白含量的测定及其与乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活力的关系。1.从牦牛心肌中提取总RNA,参照普通牛的肌红蛋白基因设计引物,用RT-PCR克隆牦牛肌红蛋白编码序列,得到了长度为640 bp的序列,经过与普通牛的肌红蛋白比对发现,核苷酸同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%,证明该序列为牦牛肌红蛋白基因的编码序列。2.用盐析、CM-Sephadex阳离子交换层析、SephadexG-50凝胶层析等方法分离纯化牦牛肌红蛋白,SDS-PAGE分析其分子量约为17ku。3.通过测定牦牛肌红蛋白含量,并与水牛、黄牛进行比较发现:牦牛心肌、骨骼肌肌红蛋白含量显著高于水牛和黄牛(P<0.01);同一动物个体,心肌肌红蛋白含量显著高于骨骼肌(P<0.01)。肌红蛋白含量与LDH、MDH活力比较分析显示:牦牛心肌、骨骼肌LDH、MDH活力显著低于水牛和黄牛(P<0.01);同一动物个体,心肌LDH活力显著低于骨骼肌(P<0.01),心肌MDH活力显著高于骨骼肌(P<0.01)。各组织肌红蛋白含量与LDH活力呈负相关(r=-0.84),与MDH活力呈正相关(r=0.32),与MDH/LDH呈正相关(r=0.95)。

关键词：牦牛肌红蛋白纯化乳酸脱氢酶苹果酸脱氢酶

哺乳动物睾丸特异乳酸脱氢酶C基因选择性剪接的研究

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哺乳动物睾丸特异乳酸脱氢酶C基因选择性剪接的研究

作者：黄林西南民族大学

学位级别：硕士

乳酸脱氢酶C (LDH-C)催化丙酮酸与L-乳酸的相互转化，通过参与细胞能量代谢在精子的发生以及获能等过程中起关键作用。采用RT-PCR方法克隆哺乳动物猪、狗、兔、猫、大鼠、小鼠及鸽子睾丸组织ldhc的开放阅读框全长序列，结果发现由于mRN... 详细信息

乳酸脱氢酶C (LDH-C)催化丙酮酸与L-乳酸的相互转化，通过参与细胞能量代谢在精子的发生以及获能等过程中起关键作用。采用RT-PCR方法克隆哺乳动物猪、狗、兔、猫、大鼠、小鼠及鸽子睾丸组织ldhc的开放阅读框全长序列，结果发现由于mRNA序列外显子缺失或者内含子部分序列插入，七个物种分别产生了2～6种数目不等的剪接体。缺失的外显子大多位于外显子5、4、6和3上。仅在狗和小鼠序列中发现部分内含子序列的插入，增加的内含子部分序列导致在该内含子中形成异常终止密码子;外显子的缺失导致部分剪接体阅读框的移码并提前形成终止子密码子。我们的实验在牦牛睾丸和肌肉组织均未发现ldha及ldhb基因的可变剪接现象。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析没有发现ldhc剪接体表达的LDH-C4蛋白的活性。对牦牛和犏牛睾丸组织ldhc基因进行克隆，测序结果分析显示成熟mRNA序列因缺失1个或多个外显子，总共出现了8种剪接体形式，且性未成熟的犊牛或雄性不育的杂交犏牛睾丸组织的剪接体比成年牦牛多。缺失的外显子多为外显子7和4。外显子的缺失同样导致部分剪接体阅读框的移码并形成终止子密码子。利用ldhc剪接体特异引物进行的实时荧光定量PCR检测显示，相对于成年牦牛而言，犊牛和犏牛的睾丸组织ldhc基因全长mRNA的表达丰度明显降低。成年牦牛、犊牛和犏牛的ldhc剪接体的相对比例也明显不同。我们的研究提示，哺乳动物睾丸组织中可能广泛存在ldhc基因的剪接现象，考虑到牦牛和犏牛的正常和性未成熟或异常睾丸组织ldhc剪接体mRNA丰度以及相对比例的差异，我们推测可变剪接可能对牦牛睾丸组织ldhc基因的表达起调控作用。

关键词：牦牛犏牛睾丸乳酸脱氢酶C 选择性剪接体杂交雄性不育

牦牛和犏牛乳外泌体microRNA高通量测序及bta-miR-143/145功能的细胞水平初步分析

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牦牛和犏牛乳外泌体microRNA高通量测序及bta-miR-143/145功能的...

作者：张建梅西南民族大学

学位级别：硕士

牦牛是一种生活在青藏高原的珍稀牛种,其乳营养价值丰富,且有很多研究资料,但有关牦牛乳中外泌体micro RNA(miRNA)的研究报道较少。本研究以四川省红原县的麦洼牦牛和犏牛乳为实验材料,从牦牛(n=44)和犏牛(n=22)乳中提取了外泌体,再通... 详细信息

牦牛是一种生活在青藏高原的珍稀牛种,其乳营养价值丰富,且有很多研究资料,但有关牦牛乳中外泌体micro RNA(miRNA)的研究报道较少。本研究以四川省红原县的麦洼牦牛和犏牛乳为实验材料,从牦牛(n=44)和犏牛(n=22)乳中提取了外泌体,再通过高通量测序分析了外泌体中miRNA。另外,对牦牛和犏牛乳中两种丰度高,但含量有显著差异的miRNA,即bta-miR-143/145的功能进行了初步的细胞水平研究。主要研究结果如下:(1)乳外泌体的提取。采用超速离心法提取了麦洼牦牛和犏牛乳外泌体,并利用透射电镜(TEM)、粒径分析仪及免疫印迹法(WB)对提取的外泌体进行了分析鉴定。结果显示:超速离心法提取的乳外泌体呈茶托样或圆盘状,平均粒径为178.2 nm,浓度为1.4×10～8个/m L;WB显示提取的外泌体均表达3种外泌体标志蛋白(HSP70、TSG101和CD81),但不含有细胞器特有的calnexin蛋白。说明乳外泌体提取成功。(2)乳外泌体miRNA高通量测序。利用高通量测序对牦牛和犏牛乳外泌体中的miRNA进行了分析,并用荧光定量PCR(q PCR)方法验证。结果表明:从高通量测序结果中选取的8个miRNAs,q PCR与高通量测序获得的表达趋势吻合,说明外泌体miRNA的高通量测序是可靠的。在全奶牦牛、半奶牦牛和犏牛乳外泌体中分别检测出405个、352个和429个成熟miRNAs,其中新的miRNAs分别为91个、56个和106个。miRNA数量的组间比较显示,全奶牦牛/半奶牦牛存在50个差异表达的miRNAs,全奶牦牛/犏牛有48个差异表达的miRNAs,半奶牦牛/犏牛存在55个差异表达的miRNAs。与全奶牦牛相比,犏牛乳外泌体中bta-miR-143/145显著下调。GO富集分析显示,上述三组乳外泌体差异miRNAs预测靶基因参与的分子功能和细胞组成相似,但参与的生物过程存在差异(P<0.01)。(3)bta-miR-143/145功能的细胞水平初步分析。体外培养caco-2细胞,分别转染bta-miR-143/145的模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)。q PCR分析表明,转染bta-miR-143/145的mimic和inhibitor,均分别实现了这两种miRNA的过表达和抑制;cck8结果显示:与对照组相比,过表达bta-miR-143/145组均能抑制细胞增殖,但转染bta-miR-143/145的inhibitor对细胞活性无显著影响;miR-143/145的过表达不影响IGF1-R的m RNA水平,但WB显示IGF1-R蛋白水平显著下调,AKT蛋白的磷酸化水平和Bcl-xl蛋白水平均下降;而转染bta-miR-143/145的inhibitor对上述蛋白质无显著作用。这些结果提示,过表达miR-143/145可抑制IGF1-R/PI3K/AKT通路的激活,促进体外培养的caco-2细胞的凋亡。由于牦牛乳中bta-miR-143/145含量高于犏牛,提示牦牛乳更有优势。

关键词：牦牛犏牛乳外泌体 microRNA

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半奶牦牛乳与全奶牦牛乳的比较生物化学研究

半奶牦牛乳与全奶牦牛乳的比较生物化学研究

作者：曹明星西南民族大学

学位级别：硕士

牦牛主要分布于中国青藏高原地区,具有乳、肉、役等多种经济价值,是高原牧民重要的日常生产资料之一。本研究的主要目的是比较半奶牦牛与全奶牦牛乳的组成特点,以此探究半奶牦牛乳腺的功能变化。试验在四川省红原县采集34头半奶牦牛和6... 详细信息

牦牛主要分布于中国青藏高原地区,具有乳、肉、役等多种经济价值,是高原牧民重要的日常生产资料之一。本研究的主要目的是比较半奶牦牛与全奶牦牛乳的组成特点,以此探究半奶牦牛乳腺的功能变化。试验在四川省红原县采集34头半奶牦牛和67头全奶牦牛的全乳,对乳的常规组分、蛋白质组成、两种乳清蛋白含量、蛋白质组学和代谢组学等进行比较,主要内容和结果如下:(1)半奶牦牛和全奶牦牛的乳常规组分与蛋白质组成比较。试验对半奶牦牛(n=34)和全奶牦牛(n=67)的全乳样品,进行常规组分、乳蛋白质组成和乳清蛋白定量比较。结果显示,半奶牦牛日挤乳量仅为全奶牦牛的53%,电导率、乳脂率和乳蛋白率高于全奶牦牛;乳铁蛋白(LF)、β-乳球蛋白(β-LG)比例及含量高于全奶牦牛,α-乳清蛋白(α-LA)比例及含量低于全奶牦牛,乳糖含量及酪蛋白(CN)比例未见差异。结果表明,半奶牦牛乳的组成与全奶牦牛有一定差异,具有泌乳期自然延长奶牛的泌乳特点。(2)半奶牦牛和全奶牦牛乳的蛋白质组学比较。试验用i TRAQ技术对半奶牦牛(n=15)全奶牦牛(n=15)的脱脂乳样品进行蛋白质组学分析。结果显示,在两种乳中共鉴定出767种蛋白质;与全奶牦牛乳相比,半奶牦牛乳中共有202个差异表达蛋白,其中109个蛋白上调,93个蛋白下调。半奶牦牛乳中维生素D结合蛋白、视黄醇结合蛋白4、乳转铁蛋白和血清转铁蛋白等功能性蛋白显著上调;半奶牦牛乳中多种血源性蛋白质显著上调,表明其乳腺细胞通透性改变,并在碳水化合物代谢、氨基酸的生物合成以及脂肪消化和吸收的途径与全奶牦牛有较大差异,推测其乳腺正处于退化阶段。(3)半奶牦牛和全奶牦牛乳的代谢组学比较。试验用UHPLC-TOF-MS联用技术对半奶牦牛(n=34)全奶牦牛(n=67)的脱脂乳样品进行非靶向代谢组学分析。共检测到694个代谢物,可分为39大类。全奶牦牛和半奶牦牛乳中共有324个差异代谢产物,其中176种代谢物含量在半奶牦牛乳中显著下调,148种上调。本研究表征了牦牛脱脂乳的代谢物谱,为牦牛泌乳科学研究提供了重要参考资料;半奶牦牛乳中的差异代谢物的表明其乳腺紧密连接通透性改变,且在糖代谢方面与全奶牦牛具有较大差异。

关键词：牦牛乳泌乳反相高效液相色谱蛋白质组学代谢组学

蜀兴1号肉兔和伊拉兔生产性能及其背最长肌转录组学和代谢组学的比较研究

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蜀兴1号肉兔和伊拉兔生产性能及其背最长肌转录组学和代谢组学的...

作者：曾建红西南民族大学

学位级别：硕士

本研究的主要目的是分析蜀兴1号肉兔和伊拉兔生产性能及其背最长肌转录组学和代谢组学的差异,探索影响二者品种差异的候选基因及代谢物,以便进一步通过分子育种改善蜀兴1号肉兔的生长发育。将健康、同期断奶的28日龄蜀兴1号肉兔和伊拉... 详细信息

本研究的主要目的是分析蜀兴1号肉兔和伊拉兔生产性能及其背最长肌转录组学和代谢组学的差异,探索影响二者品种差异的候选基因及代谢物,以便进一步通过分子育种改善蜀兴1号肉兔的生长发育。将健康、同期断奶的28日龄蜀兴1号肉兔和伊拉兔分别按照体重相近的原则分为5个组,每组24只(公母各半),总共240只。饲养试验期共42天,测定生长性能等。试验结束后每个品种挑选生长速度、活重相近的30只(公母各半)进行屠宰试验,测定屠宰性能和肉质性能,并在其中挑选体重相近、生长性能和屠宰性能差距较小的兔各8只(公母各半),屠宰试验后立刻采集背最长肌,用于后续的转录组学和代谢组学分析。主要研究结果如下。(1)生产性能比较。结果表明,在生长性能方面,蜀兴1号肉兔的日增重和料重比显著低于伊拉兔(P<0.05),育肥成活率差异不显著。在屠宰性能方面,虽然宰前活重显著低于伊拉兔,但是蜀兴1号肉兔的屠宰性能好、商业胴体率、半净膛率、全净膛率和肉骨比显著高于伊拉兔(P<0.05)。在肉质性能方面,蜀兴1号肉兔背最长肌的滴水损失显著低于伊拉兔,熟肉率显著高于伊拉兔(P<0.05),在肌肉常规组分中,蜀兴1号肉兔的脂肪含量显著高于伊拉兔,水分、蛋白质、灰分、p H值、肉色、全质构分析指标等均差异不显著。(2)转录组学研究。用转录组测序技术比较了蜀兴1号肉兔(n=8)和伊拉兔(n=8)背最长肌的基因表达,共筛选出81个差异表达基因,蜀兴1号肉兔中51个上调,30个下调。差异倍数较大的上调基因SLC7A6、MCAM和LARS2等以及下调的CALB2和LCMT2等可能是造成二者品种差异的主要候选基因。差异表达基因在t RNA加工、t RNA修饰、核转录的m RNA分解代谢过程等GO条目和c AMP信号传导途径等KEGG通路被显著富集。q PCR分析显示,蜀兴1号肉兔背最长肌的Myf5基因表达显著高于伊拉兔,而Myo G则显著下调(P<0.05),MSTN差异不显著。(3)代谢组学研究。利用GC-MS挥发性代谢组学技术比较了蜀兴1号肉兔和伊拉兔背最长肌的挥发性代谢物差异,共筛选出12个具有显著差异的代谢物,且在蜀兴1号肉兔中均上调。差异倍数较大的上调代谢物,如2-十一烯醛、4-乙基辛酸、(E)-2-壬烯醛、鸟氨酸和十一醛等可能是导致二者肉质风味差异的主要差异代谢物,并在2-氧代羧酸代谢、ABC转运蛋白和精氨酸生物合成等KEGG代谢通路显著富集。利用广泛靶向代谢组学技术比较了蜀兴1号肉兔和伊拉兔背最长肌的非挥发性代谢物差异,共筛选出15个具有显著差异的代谢物,在蜀兴1号肉兔中7个上调、8个下调。差异倍数较大的上调代谢物γ-L-谷氨酸-L-谷氨酰胺、L-谷氨酸-L-谷氨酰胺和褪黑激素以及下调的代谢物LPC等,可能是导致二者生长差异的主要非挥发性差异代谢物,并在咖啡因代谢和昼夜节律夹带等KEGG代谢通路显著富集。

关键词：蜀兴1号肉兔伊拉兔生产性能转录组学代谢组学

藏系绵羊Smo基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步分析

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藏系绵羊Smo基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步...

作者：于淼西南民族大学

学位级别：硕士

本研究的目的是构建藏系绵羊Smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体,在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究藏系绵羊Smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象... 详细信息

本研究的目的是构建藏系绵羊Smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体,在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究藏系绵羊Smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象,从皮肤中克隆了Smo基因序列,根据基因的CDS区构建了皮肤特异性真核表达载体及3个干扰载体,随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(Human hair inner root sheath cells,HHIRSC),利用荧光定量PCR技术检测藏系绵羊Smo基因以及Smo基因所在Hh通路的两个下游基因(Gli1、Gsk3β)m RNA水平的变化。主要研究成果如下:(1)获得了藏系绵羊Smo基因的编码区序列(CDS),长度为2342 bp。CDS区比对显示,Smo基因与预测的绵羊Smo基因序列有3个碱基差异,编码的蛋白质序列有1个氨基酸差异。(2)以p CDs Red2-KI真核载体为基础,构建了含KAP6.1皮肤特异表达启动子的Smo基因重组真核载体p CDs Red2-KS;以线性质粒pc DNA6.2-GW/Em GFP-mi R为主体,构建了3个干扰载体。(3)将表达载体和3个干扰载体分别转染HHIRSC,经荧光定量PCR检测转染结果,显示藏系绵羊Smo基因在转染p CDs R-KS载体的HHIRSC中高表达,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著上调(P<0.01);3个干扰载体对Smo基因均有98%以上的沉默效应,并且Gli1基因、Gsk3β基因均在m RNA水平上显著下调(P<0.01)。本研究结果表明,藏系绵羊皮肤特异真核表达载体p CDs R-KS和3个干扰载体均构建成功,可用于Smo基因功能的细胞水平研究。研究结果提示,藏系绵羊Smo基因可能通过Hh通路影响毛囊的发育或周期变化。

关键词：藏系绵羊 Smo基因真核载体干扰载体 Gli1基因 Gsk3β基因

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昌台牦牛遗传多样性蛋白和基因水平的研究

昌台牦牛遗传多样性蛋白和基因水平的研究

作者：高杰西南民族大学

学位级别：硕士

本研究的主要目的是从分子水平上研究四川昌台牦牛类群的遗传多样性，并确定其与麦洼牦牛、九龙牦牛两个牦牛品种的亲缘关系，为昌台牦牛遗传资源的合理利用提供科学依据。试验利用15个微卫星标记、线粒体DNA（mtDNA）D-loop序列、1个... 详细信息

本研究的主要目的是从分子水平上研究四川昌台牦牛类群的遗传多样性，并确定其与麦洼牦牛、九龙牦牛两个牦牛品种的亲缘关系，为昌台牦牛遗传资源的合理利用提供科学依据。试验利用15个微卫星标记、线粒体DNA（mtDNA）D-loop序列、1个表达的小卫星序列（乳上皮粘蛋白，即MUC1），以及牦牛特有的乳酸脱氢酶-1（LDH1）多态性和κ-酪蛋白（κ-CN）基因重复片段多态性，对分布于四川省的昌台牦牛、麦洼牦牛和九龙牦牛的遗传多样性进行全面的分析和比较。主要研究成果如下： 1、微卫星、小卫星和mtDNA D-loop分析显示，三个牦牛品种（类群）具有丰富的遗传多样性。昌台牦牛的基因杂合度（Ho）或单倍型多样度（Hd）均高于麦洼牦牛和九龙牦牛。 2、mtDNA D-loop分析显示，三个牦牛品种（类群）具有相近的遗传距离，提示它们在母系起源上亲缘关系较近;微卫星和MUC1多态性分析均显示，昌台牦牛与麦洼牦牛之间有更近的遗传距离。结合三个牦牛品种（类群）LDH1和κ-CN的多态性特征，我们认为昌台牦牛与麦洼牦牛的亲缘关系比其与九龙牦牛之间的亲缘关系更近。 3、本研究首次从分子水平上对昌台牦牛的遗传多样性进行了全面分析，通过与麦洼牦牛、九龙牦牛两个牦牛品种的聚类分析，初步提示昌台牦牛是一个独立的牦牛类群。 4、本研究还建立了一种简便的PCR和电泳方法，用于检测牦牛κ-CN基因第四外显子12-bp重复片段的遗传多态性。

关键词：昌台牦牛遗传多样性亲缘关系 mt DNAD-loop MUC1 微卫星 κ-酪蛋白基因乳酸脱氢酶-B(Ldhb)基因

藏系绵羊KROX20基因的克隆测序、皮肤特异性表达载体构建及其功能初步分析

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藏系绵羊KROX20基因的克隆测序、皮肤特异性表达载体构建及其功能...

作者：罗卉卉西南民族大学

学位级别：硕士

本研究对藏系绵羊皮肤特异性表达基因KROX20的编码区序列及其对细胞内信号分子表达的影响进行分析,为进一步研究KROX20基因对藏系绵羊毛囊发育和毛发生长等过程的影响奠定基础。首先,试验采集了藏系绵羊的皮肤组织,从皮肤组织中克隆了KR... 详细信息

本研究对藏系绵羊皮肤特异性表达基因KROX20的编码区序列及其对细胞内信号分子表达的影响进行分析,为进一步研究KROX20基因对藏系绵羊毛囊发育和毛发生长等过程的影响奠定基础。首先,试验采集了藏系绵羊的皮肤组织,从皮肤组织中克隆了KROX20基因的编码区序列,并对其编码区序列和氨基酸序列进行生物信息分析。然后,用Transfer-PCR(TPCR)方法构建了KROX20基因的重组皮肤特异表达载体,用构建的载体转染体外培养的绵羊毛乳头细胞(Dermal Papilla Cell,DPC)并对细胞转染条件进行了探索、优化。最后,利用荧光定量PCR及Western blot技术检测KROX20基因及其下游靶基因IGFBP5在m RNA和蛋白质水平的表达情况。本研究的主要结果如下:1.实验克隆得到了藏系绵羊KROX20基因的CDS区序列,其序列长度为1458 bp。该基因测序序列与普通绵羊KROX20基因预测序列相比(XM＿02796224.1),CDS区长39 bp(长在CDS的起始部位),匹配序列的相似性为99.51%,存在7个碱基差异(不包括长出部分的39个碱基)。藏系绵羊KROX20基因序列的碱基统计结果,碱基A、C、G、T分别占18.90%、37.70%、26.30%和17.10%。藏系绵羊KROX20基因测序序列推导的氨基酸序列,编码486个氨基酸,理论等电点为9.13,相对分子量为51.37 k D。与普通绵羊氨基酸序列(XP＿027818049.1)的匹配序列相似性为99.85%,存在2个氨基酸差异(不包括多编码的13个氨基酸)。藏系绵羊KROX20氨基酸序列中存在3个CH锌指结构域,其位置分别在该蛋白的350-374、380-401和408-429处,其氨基酸序列与绵羊、山羊相同,在其它动物中也存在类似锌指,但序列同源性不高。2.用Transfer-PCR(TPCR)方法成功构建了KROX20基因的重组皮肤特异表达载体pCDsRED-KROX20。将该重组p CDs RED-KROX20载体瞬时转染培养的绵羊毛乳头细胞,其转染效率为30.5%左右,最佳转染时间为48 h,载体与脂质体的最佳比列为1:3。3.荧光定量PCR检测表明,转染重组真核pCDsRED-KROX20的绵羊毛乳头细胞中,KROX20基因超表达约45倍,KROX20基因下游靶基因IGFBP5的m RNA水平上调约7.5倍。进一步用Western blot检测KROX20和IGFBP5蛋白的表达情况,两种蛋白质的表达量均极显著上调。这些结果表明,KROX20基因有可能通过IGF信号通路,影响藏系绵羊皮肤毛囊发育和毛发生长。

关键词：藏系绵羊 KROX20基因皮肤特异表达载体 Transfer-PCR(TPCR) IGFBP5基因