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真菌高氧化度三环倍半萜的组合生物合成

真菌高氧化度三环倍半萜的组合生物合成

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作者：冉佳灵西南大学

学位级别：硕士

倍半萜类化合物是由三个异戊烯单元组成的含有15个碳原子的天然产物,其结构多样,种类丰富,具有良好的生物活性和重要的生理功能,极具药物开发价值。在自然界中,倍半萜类化合物的生物合成是由倍半萜环化酶(STC)催化法尼基二磷酸(FPP)生... 详细信息

倍半萜类化合物是由三个异戊烯单元组成的含有15个碳原子的天然产物,其结构多样,种类丰富,具有良好的生物活性和重要的生理功能,极具药物开发价值。在自然界中,倍半萜类化合物的生物合成是由倍半萜环化酶(STC)催化法尼基二磷酸(FPP)生成倍半萜核心骨架,随后再经一系列后修饰酶催化,如氧化酶、酰基转移酶和糖基转移酶等,形成结构复杂多样的倍半萜类天然产物。在这些后修饰酶中,氧化酶在倍半萜类化合物的结构和生物活性多样性形成过程中发挥着重要作用。其中,细胞色素P450氧化酶(CYP450)可以高选择性地催化倍半萜骨架发生不同类型的氧化反应,如C-H羟基化,C=C环氧化及重排等,极大地拓宽了萜类天然产物的结构复杂性,同时为其它后修饰酶如酰基转移酶、糖基转移酶等提供了可修饰基团。由于生物酶催化具有反应条件温和,立体选择性高的优点,CYP450作为生物催化剂可以实现惰性碳骨架的氧化而极具开发潜力。然而,大多数的CYP450具有底物专一性,只能识别特异的底物,限制了它在生物酶催化上的应用。因此,如何通过挖掘具有底物宽泛性的CYP450来获得高氧化度、结构多样的倍半萜类化合物,是该研究领域面临的一个主要问题。本研究应用组合生物合成策略,将异源的STC与CYP450组合在酿酒酵母系统中表达,发现具有底物宽泛性的CYP450,并获得一系列高氧化的“非天然”倍半萜类化合物。本课题组前期报道了来源于真菌的聚奎烷silphinene(74)的合成酶Peni A,以及一个多功能的CYP450-PeniB,其能在silphinene骨架上催化一系列连续的氧化反应构建γ-内酯-[5.***.5.5]氧化窗烷环,该步骤是合成具有显著杀虫活性的penifulvin A的关键步骤。另外,文献报道来源于真菌的Bc BOT2为聚奎烷(-)-presilphiperfolan-8β-ol(67)的合成酶,CYP450-Bc BOT4为其特异性羟化酶,为合成植物毒素Botrydial的关键步骤。此外,研究表明,三环骨架67在非酶催化条件下转化为三环骨架103-105。因此,我们推测PeniB和Bc BOT4可能具有底物宽泛性(PeniB可以识别67和非天然底物103-105,Bc BOT4可以识别非天然底物74)。基于此猜想,我们利用组合生物合成结合基因挖掘策略,研究了PeniB和Bc BOT4对三环倍半萜的催化能力,力图发现具有底物宽泛性的CYP450,从而获得结构新颖的高氧化三环倍半萜化合物,本研究完成的主要工作如下:(1)基因bcbot4和peni A,peniB和bcbot2的组合生物合成研究。分别将peniB和bcbot2,bcbot4和peni A进行组合,在工程化的酵母平台(Saccharomyces cerevisiae RC01)中异源表达,代谢产物分析结果表明:Bc BOT4只能识别天然底物67,具有底物特异性;CYP450-peniB不仅能识别天然底物74,还可以催化底物103-105发生氧化反应,显示出很强的底物宽泛性。对基因peniB和bcbot2组合的共表达菌株进行大规模发酵,分离得到7个倍半萜新化合物106-112。(2)基因clade1TC分别和peniB、bcbot4的组合生物合成研究。clade1TC来源于真菌厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum),是线性三环倍半萜骨架koraiol合成酶Ffsc4的同源基因。将基因clade1TC分别和peniB、bcbot4在在酵母中异源表达,代谢产物的分析结果表明:Bc BOT4不能识别线性三环倍半萜骨架koraiol;PeniB可以催化底物koraiol发生氧化反应,通过大规模发酵和目标化合物分离,一共鉴定了3个新颖的线性三环倍半萜化合物114-116。结果表明PeniB具有较大底物宽泛性能够识别线性三环倍半萜骨架。(3)基因coll34TC分别和peniB、bcbot4的组合生物合成研究。通过序列网络相似性分析并结合化学结构指导下的基因组挖掘方法,发现并验证了一个全新的源于真菌果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的STC合成酶Coll34TC,产生三环倍半萜骨架(-)-presilphiperfolan-1β-ol和presilphiperfol-1-ene。通过化合物结构鉴定,我们推导了Coll34TC的环化机理。利用组合生物合成策略,将基因coll34TC分别和peniB及bcbot4在酵母中异源表达。代谢产物分析结果表明:Bc BOT4不能识别三环倍半萜骨架117和118,而PeniB可以选择性的催化三环倍半萜底物117和118发生氧化反应,一共鉴定了3个结构新颖的三环倍半萜氧化产物119-121。综上所述,本研究利用组合生物合成结合基因挖掘策略,

关键词：倍半萜组合生物合成倍半萜环化酶细胞色素P450氧化酶

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真菌tetramic acid类天然产物的基因组挖掘和生物合成研究

真菌tetramic acid类天然产物的基因组挖掘和生物合成研究

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作者：石虎城西南大学

学位级别：硕士

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细胞松弛素Aspochalasin生物合成途径研究

细胞松弛素Aspochalasin生物合成途径研究

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作者：刘璇西南大学

学位级别：硕士

细胞松弛素是一类具有广泛生物活性和复杂化学结构的聚酮-氨基酸杂合类真菌次级代谢产物。细胞松弛素类化合物通过与激动蛋白丝的结合影响细胞移动、胞质分裂等细胞活动,因此,其具有良好的抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫和抗HIV病毒等活性,... 详细信息

细胞松弛素是一类具有广泛生物活性和复杂化学结构的聚酮-氨基酸杂合类真菌次级代谢产物。细胞松弛素类化合物通过与激动蛋白丝的结合影响细胞移动、胞质分裂等细胞活动,因此,其具有良好的抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫和抗HIV病毒等活性,展现了良好的药物先导化合物潜力,具有重要的开发价值。细胞松弛素具有11-14个碳的大环并异吲哚酮环的三环核心骨架。但是,由于参入氨基酸种类的不同,聚酮链具有不同程度的氧化修饰,以及大环被氧化断裂开环或形成多环体系等修饰,细胞松弛素的结构呈现多样性。除此而外,其它化学结构与细胞松弛素结构的聚合,更是极大地丰富了其结构的复杂性。对细胞松弛素生物合成的研究,了解其合成规律与机制,可以为后续采用途径工程或代谢工程方法,定向创制生物活性更好的细胞松弛素类化合物奠定基础。近20年来,细胞松弛素的生物合成基因簇已被广泛报道。细胞松弛素生物合成基因簇除了细胞色素P450单氧化酶、核黄素依赖的单加氧酶、氧化还原酶、氧乙酰基转移酶等后修饰基因以外,还有由高度保守的聚酮-非核糖体肽合成酶、烯醇还原酶、α/β-水解酶和Diels–Alder环化酶四个基因组成的核心骨架基因盒。基于众多生物合成基因簇的确定,细胞松弛素类化合物的后修饰途径已被广泛研究与阐明,但是(1)由核心骨架基因盒形成的细胞松弛素的最初骨架结构是什么?(2)多聚化或多环化类型的细胞松弛素化合物的形成机制是什么?等细胞松弛素合成过程中的基本科学问题并未得到解决。基于上述科学问题,我们选择亮氨酸类细胞松弛素aspochalasin类化合物作为研究对象,采用异源生物合成策略,取得如下结果:(1)在黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)KLA03中鉴定了负责aspochalasin类化合物合成的基因簇aspo。该基因簇共有八个基因,除了高度保守的聚酮-非核糖体肽合成酶(Aspo E)、烯醇还原酶(Aspo H)、α/β-水解酶(Aspo C)、Diels–Alder环化酶(Aspo B)外,还有核黄素依赖的氧化酶(Aspo A)、细胞色素P450单氧化酶(Aspo F)、短链脱氢/还原酶(Aspo D)和转录调节因子(Aspo G);(2)通过在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中异源表达的方式,解析了aspochalasin母核骨架和终产物的完整合成途径。其中由aspo EHCB合成的aspochalasin Z为aspochalasin类化合物的核心骨架结构;(3)通过体内与体外实验,相继阐明了Aspo F,Aspo A和Aspo D的催化顺序与催化功能。其中Aspo F负责aspochalasin Z上C和C位惰性碳骨架的连续C-H羟化反应,分别生成TMC169和aspochalasin D;Aspo A催化罕见的异构化反应,并依赖于烯醇互变反应,巧妙地消除了TMC169和aspochalasin D中C-C双键,将二者转变为aspochalasin Q和aspochalasin P;Aspo D催化位置选择性的还原反应,能高效地将aspochalasin Q和aspochalasin P中C位的酮基还原生成periconiasin A和flavichalasine G,其中aspochalasin P可能为其最适底物;(4)在酸性条件下,三环的TMC169和aspochalasin D会分别自发形成多环的F14945-D1和aspergilin PZ,且以TMC169为例,我们发现酸性条件下,其可与腺嘌呤和半胱氨酸发生自发聚合形成多聚产物,但aspochalasin Q在相同条件下并不能发生上述多环形成与聚合反应。由此说明,多环与多聚类aspochalasin化合物的生成依赖于C-酮-C-C不饱和双键的高反应性;(5)Aspo A的催化机理,F14945-D1和aspergilin PZ的自发转化的形成机理均得到合理推测。综上所述,通过合成基因体内异源表达、化合物体内喂养和生物酶体外转化等方法,本课题重点阐明了aspo基因簇中各基因的催化功能和aspochalasin类化合物的完整合成途径,并证实了aspochalasin Z为aspochalasin类化合物的核心骨架结构;发现并验证了Aspo A催化双键异构化反应的功能,揭示了分离所获得的aspochalasin类多环与聚合化合物可能为自发产物的后续衍生产物,其中Aspo A催化的异构化反应是aspochalasin类化合物天然途径与自发途径的转化开关。本课题的研究结果,为了解细胞松弛素类化合物结构多样性和复杂性的转化关系,及后续细胞松弛素类化合物的代谢工程改造提供了明确且可参考的研究基础。

关键词：细胞松弛素生物合成非天然产物异构化异源表达

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真菌高度还原型聚酮合酶与Ⅲ型聚酮合酶杂合天然产物的基因组挖掘

真菌高度还原型聚酮合酶与Ⅲ型聚酮合酶杂合天然产物的基因组挖掘

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作者：黄雨婷西南大学

学位级别：硕士

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基于STEAM理念的项目式学习设计与应用研究——以初中信息技术课程为例

基于STEAM理念的项目式学习设计与应用研究——以初中信息技术课...

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作者：裴亚超牡丹江师范学院

学位级别：硕士

目前,项目式学习逐渐成为信息技术学科常用的教学方式之一,但是在其实践中仍存在一些不足,例如教师只关注本学科,忽视多学科的融合;教师提出的项目脱离实际,忽视学生的兴趣等。而近年来STEAM理念逐渐成为教育领域中的研究热点之一,它具... 详细信息

目前,项目式学习逐渐成为信息技术学科常用的教学方式之一,但是在其实践中仍存在一些不足,例如教师只关注本学科,忽视多学科的融合;教师提出的项目脱离实际,忽视学生的兴趣等。而近年来STEAM理念逐渐成为教育领域中的研究热点之一,它具有跨学科性、实践性和综合性等特点,可以弥补目前项目式学习实施过程中的不足,是实践项目式学习所秉承的重要理念。本研究将STEAM理念和项目式学习相结合,发挥各自的优势,以提高学生培养质量。研究方法主要采用文献研究法、问卷调查法、访谈法、观察法以及行动研究法。首先,通过文献研究法了解STEAM理念和项目式学习的相关理论及研究现状,为后续的研究提供基础和研究思路;其次,通过问卷调查法及访谈法发现:目前初中信息技术课程中项目式学习存在项目脱离生活实际、小组合作任务分配不均及学生跨学科解决问题的意识薄弱等一些问题,除此之外,通过文献研究法发现项目式学习与STEAM理念相融合具备可行性;再次,设计相应学习流程并将其应用到初中信息技术教学中,将此流程经过三轮改进,最终设计出较为完善的学习流程;最后,根据学生学习情况量表前后测数据、课堂表现以及作品综合成绩,对所设计的基于STEAM理念的项目式学习流程的效果进行了分析,得出结论:该学习流程可以提高学生的学习兴趣、团队合作能力以及跨学科解决问题能力。

关键词：项目式学习 STEAM理念初中信息技术课程

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