真菌高氧化度三环倍半萜的组合生物合成

作     者：冉佳灵 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹懿

授予年度：2023年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：倍半萜 组合生物合成 倍半萜环化酶 细胞色素P450氧化酶 

摘      要：倍半萜类化合物是由三个异戊烯单元组成的含有15个碳原子的天然产物,其结构多样,种类丰富,具有良好的生物活性和重要的生理功能,极具药物开发价值。在自然界中,倍半萜类化合物的生物合成是由倍半萜环化酶(STC)催化法尼基二磷酸(FPP)生成倍半萜核心骨架,随后再经一系列后修饰酶催化,如氧化酶、酰基转移酶和糖基转移酶等,形成结构复杂多样的倍半萜类天然产物。在这些后修饰酶中,氧化酶在倍半萜类化合物的结构和生物活性多样性形成过程中发挥着重要作用。其中,细胞色素P450氧化酶(CYP450)可以高选择性地催化倍半萜骨架发生不同类型的氧化反应,如C-H羟基化,C=C环氧化及重排等,极大地拓宽了萜类天然产物的结构复杂性,同时为其它后修饰酶如酰基转移酶、糖基转移酶等提供了可修饰基团。由于生物酶催化具有反应条件温和,立体选择性高的优点,CYP450作为生物催化剂可以实现惰性碳骨架的氧化而极具开发潜力。然而,大多数的CYP450具有底物专一性,只能识别特异的底物,限制了它在生物酶催化上的应用。因此,如何通过挖掘具有底物宽泛性的CYP450来获得高氧化度、结构多样的倍半萜类化合物,是该研究领域面临的一个主要问题。本研究应用组合生物合成策略,将异源的STC与CYP450组合在酿酒酵母系统中表达,发现具有底物宽泛性的CYP450,并获得一系列高氧化的“非天然倍半萜类化合物。本课题组前期报道了来源于真菌的聚奎烷silphinene(74)的合成酶Peni A,以及一个多功能的CYP450-PeniB,其能在silphinene骨架上催化一系列连续的氧化反应构建γ-内酯-[5.***.5.5]氧化窗烷环,该步骤是合成具有显著杀虫活性的penifulvin A的关键步骤。另外,文献报道来源于真菌的Bc BOT2为聚奎烷(-)-presilphiperfolan-8β-ol(67)的合成酶,CYP450-Bc BOT4为其特异性羟化酶,为合成植物毒素Botrydial的关键步骤。此外,研究表明,三环骨架67在非酶催化条件下转化为三环骨架103-105。因此,我们推测PeniB和Bc BOT4可能具有底物宽泛性(PeniB可以识别67和非天然底物103-105,Bc BOT4可以识别非天然底物74)。基于此猜想,我们利用组合生物合成结合基因挖掘策略,研究了PeniB和Bc BOT4对三环倍半萜的催化能力,力图发现具有底物宽泛性的CYP450,从而获得结构新颖的高氧化三环倍半萜化合物,本研究完成的主要工作如下:(1)基因bcbot4和peni A,peniB和bcbot2的组合生物合成研究。分别将peniB和bcbot2,bcbot4和peni A进行组合,在工程化的酵母平台(Saccharomyces cerevisiae RC01)中异源表达,代谢产物分析结果表明:Bc BOT4只能识别天然底物67,具有底物特异性;CYP450-peniB不仅能识别天然底物74,还可以催化底物103-105发生氧化反应,显示出很强的底物宽泛性。对基因peniB和bcbot2组合的共表达菌株进行大规模发酵,分离得到7个倍半萜新化合物106-112。(2)基因clade1TC分别和peniB、bcbot4的组合生物合成研究。clade1TC来源于真菌厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum),是线性三环倍半萜骨架koraiol合成酶Ffsc4的同源基因。将基因clade1TC分别和peniB、bcbot4在在酵母中异源表达,代谢产物的分析结果表明:Bc BOT4不能识别线性三环倍半萜骨架koraiol;PeniB可以催化底物koraiol发生氧化反应,通过大规模发酵和目标化合物分离,一共鉴定了3个新颖的线性三环倍半萜化合物114-116。结果表明PeniB具有较大底物宽泛性能够识别线性三环倍半萜骨架。(3)基因coll34TC分别和peniB、bcbot4的组合生物合成研究。通过序列网络相似性分析并结合化学结构指导下的基因组挖掘方法,发现并验证了一个全新的源于真菌果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的STC合成酶Coll34TC,产生三环倍半萜骨架(-)-presilphiperfolan-1β-ol和presilphiperfol-1-ene。通过化合物结构鉴定,我们推导了Coll34TC的环化机理。利用组合生物合成策略,将基因coll34TC分别和peniB及bcbot4在酵母中异源表达。代谢产物分析结果表明:Bc BOT4不能识别三环倍半萜骨架117和118,而PeniB可以选择性的催化三环倍半萜底物117和118发生氧化反应,一共鉴定了3个结构新颖的三环倍半萜氧化产物119-121。综上所述,本研究利用组合生物合成结合基因挖掘策略,