细胞松弛素Aspochalasin生物合成途径研究

作     者：刘璇 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹懿

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：细胞松弛素 生物合成 非天然产物 异构化 异源表达 

摘      要：细胞松弛素是一类具有广泛生物活性和复杂化学结构的聚酮-氨基酸杂合类真菌次级代谢产物。细胞松弛素类化合物通过与激动蛋白丝的结合影响细胞移动、胞质分裂等细胞活动,因此,其具有良好的抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫和抗HIV病毒等活性,展现了良好的药物先导化合物潜力,具有重要的开发价值。细胞松弛素具有11-14个碳的大环并异吲哚酮环的三环核心骨架。但是,由于参入氨基酸种类的不同,聚酮链具有不同程度的氧化修饰,以及大环被氧化断裂开环或形成多环体系等修饰,细胞松弛素的结构呈现多样性。除此而外,其它化学结构与细胞松弛素结构的聚合,更是极大地丰富了其结构的复杂性。对细胞松弛素生物合成的研究,了解其合成规律与机制,可以为后续采用途径工程或代谢工程方法,定向创制生物活性更好的细胞松弛素类化合物奠定基础。近20年来,细胞松弛素的生物合成基因簇已被广泛报道。细胞松弛素生物合成基因簇除了细胞色素P450单氧化酶、核黄素依赖的单加氧酶、氧化还原酶、氧乙酰基转移酶等后修饰基因以外,还有由高度保守的聚酮-非核糖体肽合成酶、烯醇还原酶、α/β-水解酶和Diels–Alder环化酶四个基因组成的核心骨架基因盒。基于众多生物合成基因簇的确定,细胞松弛素类化合物的后修饰途径已被广泛研究与阐明,但是(1)由核心骨架基因盒形成的细胞松弛素的最初骨架结构是什么?(2)多聚化或多环化类型的细胞松弛素化合物的形成机制是什么?等细胞松弛素合成过程中的基本科学问题并未得到解决。基于上述科学问题,我们选择亮氨酸类细胞松弛素aspochalasin类化合物作为研究对象,采用异源生物合成策略,取得如下结果:(1)在黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)KLA03中鉴定了负责aspochalasin类化合物合成的基因簇aspo。该基因簇共有八个基因,除了高度保守的聚酮-非核糖体肽合成酶(Aspo E)、烯醇还原酶(Aspo H)、α/β-水解酶(Aspo C)、Diels–Alder环化酶(Aspo B)外,还有核黄素依赖的氧化酶(Aspo A)、细胞色素P450单氧化酶(Aspo F)、短链脱氢/还原酶(Aspo D)和转录调节因子(Aspo G);(2)通过在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中异源表达的方式,解析了aspochalasin母核骨架和终产物的完整合成途径。其中由aspo EHCB合成的aspochalasin Z为aspochalasin类化合物的核心骨架结构;(3)通过体内与体外实验,相继阐明了Aspo F,Aspo A和Aspo D的催化顺序与催化功能。其中Aspo F负责aspochalasin Z上C和C位惰性碳骨架的连续C-H羟化反应,分别生成TMC169和aspochalasin D;Aspo A催化罕见的异构化反应,并依赖于烯醇互变反应,巧妙地消除了TMC169和aspochalasin D中C-C双键,将二者转变为aspochalasin Q和aspochalasin P;Aspo D催化位置选择性的还原反应,能高效地将aspochalasin Q和aspochalasin P中C位的酮基还原生成periconiasin A和flavichalasine G,其中aspochalasin P可能为其最适底物;(4)在酸性条件下,三环的TMC169和aspochalasin D会分别自发形成多环的F14945-D1和aspergilin PZ,且以TMC169为例,我们发现酸性条件下,其可与腺嘌呤和半胱氨酸发生自发聚合形成多聚产物,但aspochalasin Q在相同条件下并不能发生上述多环形成与聚合反应。由此说明,多环与多聚类aspochalasin化合物的生成依赖于C-酮-C-C不饱和双键的高反应性;(5)Aspo A的催化机理,F14945-D1和aspergilin PZ的自发转化的形成机理均得到合理推测。综上所述,通过合成基因体内异源表达、化合物体内喂养和生物酶体外转化等方法,本课题重点阐明了aspo基因簇中各基因的催化功能和aspochalasin类化合物的完整合成途径,并证实了aspochalasin Z为aspochalasin类化合物的核心骨架结构;发现并验证了Aspo A催化双键异构化反应的功能,揭示了分离所获得的aspochalasin类多环与聚合化合物可能为自发产物的后续衍生产物,其中Aspo A催化的异构化反应是aspochalasin类化合物天然途径与自发途径的转化开关。本课题的研究结果,为了解细胞松弛素类化合物结构多样性和复杂性的转化关系,及后续细胞松弛素类化合物的代谢工程改造提供了明确且可参考的研究基础。