检索结果-南通市图书馆

作者：童娜华中农业大学

学位级别：硕士

本论文研究热应激对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)凋亡的影响。设置4个不同的实验温度来培养细胞：28℃.32℃.36℃.40℃,其中的28℃是CIK细胞最适生长温度,将这个温度组的细胞... 详细信息

本论文研究热应激对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)凋亡的影响。设置4个不同的实验温度来培养细胞：28℃.32℃.36℃.40℃,其中的28℃是CIK细胞最适生长温度,将这个温度组的细胞作为对照组。用上述温度对细胞进行2h的急性热应激和24h连续热应激处理,每实验组3个重复,检测细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率、细胞周期、细胞凋亡率、细胞DNA断裂情况、多泛素蛋白的表达量以及凋亡相关的基因caspase-3和bcl-2的表达量等指标,并对细胞形态的变化进行了观察。主要研究结果如下：1.急性热应激对CIK细胞的影响在不同温度的急性应激作用下,细胞存活率随着处理温度的升高均有显著性(p<0.05)的下降;乳酸脱氢酶的漏出率随着应激温度的升高而增加,36℃和40℃比对照组显著(p<0.05)的增多;急性热应激处理后对细胞内多泛素蛋白和凋亡相关基因表达的检测发现,随着应激温度升高细胞内多泛素蛋白的表达量增加,并且36℃和40℃组的蛋白表达比对照组显著(p<0.05)的升高;凋亡基因caspase-3随着应激温度的升高表达量增多且36℃和40℃组与对照组有显著性差异(p<0.05), bcl-2随着应激温度的升高表达量降低,且32℃和40℃处理组与对照组有显著性差异(p<0.05),Bcl-2蛋白表达量逐渐降低。流式细胞仪检测细胞周期没有规律的变化。热应激处理后的细胞经过荧光染色后显微镜观察发现,部分细胞的胞质中出现空泡,也有细胞核固缩的现象发生。实验结果说明较高温度的急性热应激会破坏细胞膜,使细胞膜的通透性增加,同时也会降低细胞活性,多泛素蛋白表达的增加说明热应激使细胞受到了损伤,凋亡相关基因cnspase-3和bcl-2的表达变化也说明细胞的凋亡通路开启了,但各处理组的细胞没有大规模的凋亡发生,并且发生的凋亡对处于不同分裂时期的细胞没有选择性。2.连续热应激对CIK细胞的影响细胞热应激处理2h、6h、12h、24h,热应激处理的温度越高细胞活力下降的越快,处理6h的40℃组与28℃相比显著性下降(p<0.05),12h和24h各个处理组与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。LDH的漏出率与热应激的处理时间和处理温度均成正比,6h和24h的40℃处理组与对照组相比有显著性(p<0.05)的升高。热应激处理12h和24h后流式细胞仪检测细胞凋亡率,各个处理组细胞凋亡率基本上是随着热应激温度升高而增加的。而对热应激后细胞DNA的断裂情况的检测发现热应激后细胞的DNA会有一定的损伤。透射电镜观察发现热应激后的细胞胞质空泡化比较严重。实验结果说明：连续的热应激亦会对细胞造成一定的损伤,损伤细胞膜和细胞器并且热应激会造成细胞活性的下降,同时较长时间的热应激会造成细胞凋亡率的增加,温度热应激后可检测出DNA Ladder即小片段的DNA增多,说明热应激会造成DNA的断裂,这也是细胞凋亡的标志之一。

关键词：热应激草鱼肾细胞系细胞凋亡斑点杂交天冬氨酸蛋白水解酶-3

亚硒酸钠对草鱼肾脏细胞和斑点叉尾鮰卵巢细胞作用研究

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亚硒酸钠对草鱼肾脏细胞和斑点叉尾鮰卵巢细胞作用研究

作者：田珍华中农业大学

学位级别：硕士

以不同浓度亚硒酸钠(NaSeO)体外培养斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)和草鱼肾脏细胞(CIK),培养不同时间下,观察NaSeO对细胞形态的影响和对细胞生长及抗氧化能力的影响。并在此基础上选择合适的NaSeO浓度,通过滴度测定和噬斑实验,研究NaSeO抗病... 详细信息

以不同浓度亚硒酸钠(NaSeO)体外培养斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)和草鱼肾脏细胞(CIK),培养不同时间下,观察NaSeO对细胞形态的影响和对细胞生长及抗氧化能力的影响。并在此基础上选择合适的NaSeO浓度,通过滴度测定和噬斑实验,研究NaSeO抗病毒的作用。结果表明:NaSeO对CCO的作用呈浓度和时间依赖性。低浓度的NaSeO对细胞的形态和生长没有显著的影响,而随着NaSeO浓度的增加(≥5μmol/L)和作用CCO的时间的延长(≥24 h),细胞生长受到抑制,细胞形态出现损伤样变化,并随着NaSeO浓度的增加,抑制作用增强。NaSeO(≥10μmol/L)作用CCO 24h,细胞内的超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著下降,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率显著增加,脂质过氧化水平(丙二醛,MDA)的含量显著升高,提示细胞受到严重氧化损伤。10 nmol/L的NaSeO对CIK的生长有显著的促进作用(P＜0.05),而随着NaSeO浓度的增加(≥100μmol/L)和作用CIK的时间的延长(≥24 h),细胞生长受到抑制,细胞出现损伤样变化,细胞变圆,脱落,贴壁细胞数量减少。NaSeO浓度达到1 mmol/L时会引起CIK细胞脂质过氧化水平提高,引起氧化损伤和细胞膜损伤,同时说明与CIK相比较,CCO对NaSeO更敏感。1μmol/L NaSeO作用CCO和CIK 24 h后感染斑点叉尾鮰病毒(CCV)和草鱼呼肠孤病毒(GCRV),与对照组相比较,病毒的滴度均降低了一个数量级,而感染病毒后加入1μmol/L NaSeO或者将NaSeO与病毒作用后再感染细胞均未出现与对照组明显的差异性。以上结果都表明,1μmol/L NaSeO能预防病毒感染,抑制病毒的吸附作用,这可能与NaSeO能提高抗氧化能力来减少入侵病毒造成的损伤有关。

关键词：亚硒酸钠 CCO CIK 细胞生长 CCV GCRV 抗病毒

亚硝酸盐急性暴露激活草鱼肝和肾IRE1通路及诱导细胞凋亡的研究

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亚硝酸盐急性暴露激活草鱼肝和肾IRE1通路及诱导细胞凋亡的研究

作者：陈思琪华中农业大学

学位级别：硕士

随着高密度集约化养殖模式的不断发展,大量的含氮有机物沉积水体中,导致水体中亚硝酸盐浓度不断升高。高浓度亚硝酸盐暴露会引起鱼类产生氧化应激,造成未折叠、错折叠、突变蛋白积累,破坏内质网稳态并引起内质网应激,导致鱼类的大量死... 详细信息

随着高密度集约化养殖模式的不断发展,大量的含氮有机物沉积水体中,导致水体中亚硝酸盐浓度不断升高。高浓度亚硝酸盐暴露会引起鱼类产生氧化应激,造成未折叠、错折叠、突变蛋白积累,破坏内质网稳态并引起内质网应激,导致鱼类的大量死亡。为了应对这种环境应激,机体内质网会做出未折叠蛋白反应的保护性或适应性策略,以恢复内质网的稳态,如果内质网应激持续,细胞会开始出现凋亡。本研究分别从内质网应激和细胞凋亡的角度,探究了亚硝酸钠对草鱼肝脏组织、肝细胞和肾细胞的毒性损伤,以期为草鱼的科学化养殖提供可靠的科学理论依据。亚硝酸钠急性暴露草鱼实验中,分别用0 mg/L、8 mg/L、13 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠的溶液暴露草鱼,暴露时间为0 h,12 h,24 h,48 h和96 h,每个实验组设3个重复。实验结束后,采集草鱼的肝脏组织,进行细胞凋亡和内质网应激IRE1通路相关基因相对表达量、生化指标和抗氧化酶活性检测,采集草鱼鳃组织和肝脏组织检测组织学变化。亚硝酸钠急性暴露草鱼肝细胞实验中,分别用0 mg/L、5 mg/L、20 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠溶液暴露草鱼肝细胞(L8824),在暴露后12 h和24 h后,检测细胞活力、细胞凋亡和内质网应激IRE1通路相关基因相对表达量、细胞凋亡率以及细胞内游离钙离子变化。加入内质网应激通路IRE1α核酸内切酶的抑制剂,进行细胞活力、内质网应激IRE1通路和细胞凋亡相关基因相对表达量、细胞凋亡率以及细胞质内游离钙离子变化的检测。亚硝酸钠急性暴露草鱼肾细胞(CIK)实验中,分别用0 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠溶液处理草鱼肾细胞12 h和24 h后,检测细胞活性、内质网应激和细胞凋亡相关基因相对表达量、细胞凋亡率。实验结果如下:1.对照组草鱼的鳃组织中,鳃片及鳃丝排列紧密有序,结构完整。草鱼暴露在50 mg/L亚硝酸盐96 h后,鳃小片出现基底上皮的增厚黏液细胞分泌增多,鳃小叶黏连,黏液细胞大量浸润鳃小叶之间,鳃小叶增生扭曲。对照组草鱼的肝脏组织中,肝细胞总体形态规律,细胞核位置明显,但在50 mg/L的亚硝酸盐暴露96 h后,出现了明显脂肪空泡化现象,组织充血,肝细胞水肿,细胞质溶解。肝糖原的含量在亚硝酸钠暴露高浓度组发生显著性的降低,碱性磷酸酶在亚硝酸钠暴露12 h和24 h发生了显著性的上升,而在亚硝酸钠暴露48 h和96 h后发生了显著性的下降,在亚硝酸钠暴露12 h后SOD的活性显著升高,而在随着暴露毒时间的延长,SOD的活性与对照相比显著下降。grp78、ire1α和xbp1s mRNA在亚硝酸钠暴露后表达量与对照相比明显上升,其中grp78 mRNA表达量在亚硝酸盐暴露96 h后达到最大值,而ire1α和xbp1s表达量在暴露12 h后达到最大值。2.亚硝酸钠急性暴露草鱼肝细胞实验中,亚硝酸钠处理组的细胞凋亡率显著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表达量显著升高,bcl-2 mRNA的表达量显著下降,细胞内钙离子浓度显著上升。与亚硝酸钠单处理组相比,加入IRE1α核酸内切酶抑制剂(STF-083010)处理组的细胞凋亡率显著下降,ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase3 mRNA表达量显著下降,bcl-2 mRNA表达量显著上升,加入IP3R通道的抑制剂(2-APB)或STF-083010处理组的细胞内钙离子浓度均显著下降。3.亚硝酸钠急性暴露草鱼肾细胞实验中,细胞活性显著降低,AO染色结果显示亚硝酸钠处理组细胞核和细胞质内荧光强度增强,细胞凋亡率显著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表达量在高浓度亚硝酸钠暴露后显著升高。ire1α、xbp1s、grp78 mRNA表达量在低浓度亚硝酸钠暴露时显著升高,随着时间的延长,表达量显著下降。综上所述,亚硝酸盐急性暴露导致草鱼应激,造成肝脏组织和鳃组织损伤,肝脏生化指标和抗氧化酶活性发生显著性变化,肝脏组织、肝细胞和肾细胞内质网应激IRE1通路和细胞凋亡相关基因的表达显著升高,肝细胞和肾细胞活性显著降低,凋亡率显著升高,肝细胞内钙离子浓度显著上升。在亚硝酸钠暴露引起的草鱼肝细胞凋亡中,内质网应激IRE1通路发挥一定作用。

关键词：亚硝酸钠草鱼内质网应激细胞凋亡 IRE1通路

温度和亚硝酸盐对草鱼肾细胞、血细胞及肝细胞抗氧化体系的影响

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温度和亚硝酸盐对草鱼肾细胞、血细胞及肝细胞抗氧化体系的影响

作者：尹晓燕华中农业大学

学位级别：硕士

为探究温度和亚硝酸盐对草鱼(ctenopharyngodon idellus)组织细胞的应激作用及其细胞水平的反应机理,本文进行了以下三个方面的研究：(1)温度对草鱼肾细胞(CIK)的氧化与抗氧化指标及抗氧化物酶相关基因表达水平的影响;(2)亚硝酸盐对草... 详细信息

为探究温度和亚硝酸盐对草鱼(ctenopharyngodon idellus)组织细胞的应激作用及其细胞水平的反应机理,本文进行了以下三个方面的研究：(1)温度对草鱼肾细胞(CIK)的氧化与抗氧化指标及抗氧化物酶相关基因表达水平的影响;(2)亚硝酸盐对草鱼离体血细胞的胞内氧化及抗氧化指标、血红蛋白及高铁血红蛋白含量、及抗氧化物酶相关基因表达水平的影响;(3)亚硝酸盐对草鱼离体肝细胞的抗氧化物酶活性的影响。在研究(1)中采用的实验细胞为来自华中农业大学水产学院的CIK传代细胞。在研究(2)和(3)中采用体质量为(65.8±5.5)g的草鱼幼鱼为材料,在无菌条件下提取草鱼血细胞并制备离体肝细胞,设置3个亚硝酸盐暴露组(1.0mg/L、10.0mg/L、100.0mg/L)和1个空白对照组(0mg/L组),各实验组设置3个重复,离体血细胞实验分别暴露0h、3h、6h、12h、24h,离体肝细胞实验分别暴露0h、6h、12h、24h、48h、96h。研究结果如下：1.温度对草鱼肾细胞的氧化应激水平的影响在急性温度变化下,无论升高温度4℃或者降低温度4℃都会导致胞内氧化应激水平发生改变,这主要体现在活性氧(ROS)水平的升高,线粒体跨膜电位(△甲m)发生显著性升高,细胞的脂质氧化损伤指标丙二醛(MDA)的显著增加,高温诱导的蛋白质氧化指标蛋白质羰基化含量的持续升高。低温显著性的影响胞内总抗氧化能力(TAC)活性,升温处理和降温处理对谷胱甘肽(GSH)活性的升高也具有显著性影响。对酶活指标的分析中,在升温和降温中都检测到超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性高于对照组,谷胱甘肽还原酶(GR)活性在升温组中表现出随温度升高而升高,在基因的转录水平上,通过对sod, cat, gpx三个基因的荧光定量分析发现,无论是升温处理还是降温处理,这3个抗氧化物酶基因的转录水平都高于对照组28℃组的水平。2.亚硝酸盐急性暴露对草鱼氧化及抗氧化指标和抗氧化酶基因水平的影响亚硝酸盐暴露对草鱼血细胞的活性氧、血红蛋白含量、过氧化脂质的含量、线粒体跨膜电位和关键代谢酶活性及其基因的相对表达量均产生了显著影响。亚硝酸盐对草鱼血细胞的影响作用体现出剂量—效应和时间—效应关系。随着亚硝酸盐的暴露浓度的升高,胞内的ROS水平、线粒体跨膜电位、脂质氧化指标MDA均表现出先升高后降低的趋势;CAT, SOD, GPx,谷胱甘肽巯基转移酶(GST),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(y-GCS),乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性表现出先升高后降低的趋势,GSH和TAC活性同样也表现出先升高后降低的趋势;对抗氧化相关酶活基因的研究发现,同一时间点,sod, cat, gpx基因的转录水平都会随着亚硝酸盐的暴露浓度的增加而表现出先升高后降低的趋势。活性氧水平的升高预示机体的自由基代谢能力的变化和氧化应激水平的加剧。长时间低浓度的亚硝酸盐暴露对细胞造成的损伤超出细胞自身的抗氧化修复能力。3.亚硝酸盐急性暴露对草鱼离体肝细胞抗氧化性能的影响亚硝酸盐急性暴露对草鱼离体肝细胞的非特异性免疫和抗氧化性能产生了显著影响,SOD、CAT、LDH、GST、γ-GCS、GSH和TAC都随着亚硝酸盐的作用浓度和作用时间的变化而表现出先升高后降低的趋势,低浓度的亚硝酸盐的长时间处理导致酶活性的显著升高预示着离体肝细胞内非特异性免疫性能的增强和胞内自由基的代谢能力的提高,同时也预示着胞内的氧化应激程度的提高。

关键词：亚硝酸盐热应激草鱼氧化应激基因表达血红蛋白

氯化铵对斑马鱼肝细胞和草鱼肝细胞损伤的研究

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氯化铵对斑马鱼肝细胞和草鱼肝细胞损伤的研究

作者：胡振义华中农业大学

学位级别：硕士

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国重要的淡水养殖鱼类之一,随着集约化养殖的推广,高密度的草鱼养殖已成为常态。而在高密度的养殖过程中,会导致氨氮含量的增加。暴露在高浓度的氨氮水平下,草鱼的机体免疫系统受到抑制,同时高浓度... 详细信息

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国重要的淡水养殖鱼类之一,随着集约化养殖的推广,高密度的草鱼养殖已成为常态。而在高密度的养殖过程中,会导致氨氮含量的增加。暴露在高浓度的氨氮水平下,草鱼的机体免疫系统受到抑制,同时高浓度氨氮会诱导草鱼氧化应激。肝脏作为动物体的解毒器官,其健康程度直接决定了养殖草鱼的健康状态和生长。目前对氨氮影响的研究主要集中在鱼体等个体水平,本研究以斑马鱼肝细胞系（ZFL）和草鱼肝细胞系（L8824）为研究对象,在细胞水平探究氯化铵暴露对肝细胞生长的影响和损伤的机制。1、本研究将ZFL细胞暴露于氯化铵中,以模式动物斑马鱼的肝细胞系为研究对象,旨在揭示氯化铵引起ZFL细胞凋亡的机制。结果表明,氯化铵的暴露会抑制ZFL细胞的生长,显著降低细胞活力。通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态,发现氯化铵暴露后会导致ZFL细胞出现早期凋亡,细胞脱落和死亡。同时氯化铵的暴露会激活ZFL细胞的抗氧化系统,细胞内的活性氧（ROS）水平出现一定程度的降低。内质网应激相关基因atf6、hspa5、xbp1s、ern1、chop、atf4b1、eif2s1的相对表达水平出现持续性的增加,并且最大值都出现在10mmol/L氯化铵暴露组中,但基因eif2ak3的表达水平出现先升高后降低的情况,这说明了氯化铵诱导ZFL细胞发生内质网应激（ERS）。同时氯化铵暴露会造成ZFL细胞的凋亡率增加,且随着氯化铵的暴露浓度增加,ZFL细胞的凋亡率也增加。2、本研究将L8824细胞暴露于氯化铵中,研究氯化铵对草鱼肝细胞损伤和凋亡的影响及其机制。结果表明,氯化铵暴露导致L8824细胞的活力下降,谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量上升。细胞内ROS和丙二醛（MDA）水平升高,而线粒体膜电位降低,提示氯化铵诱导氧化应激,L8824细胞遭受氧化损伤。检测发现,ERS相关通路基因perk、atf4和ire-1α的相对表达量增加。使用ERS抑制剂2-APB预孵育L8824细胞可减少氯化铵诱导的内质网钙离子释放。暴露于氯化铵后,L8824细胞的凋亡率增加。以上结果表明,氯化铵可通过诱导氧化应激和内质网应激对L8824细胞产生毒性作用,导致L8824细胞凋亡。

关键词：斑马鱼肝细胞草鱼肝细胞氧化应激内质网应激细胞凋亡

硒对亚硝酸钠引致的草鱼肝肾细胞损伤的保护作用研究

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硒对亚硝酸钠引致的草鱼肝肾细胞损伤的保护作用研究

作者：姚朝瑞华中农业大学

学位级别：硕士

近年来水产养殖规模不断扩大,高密度集约化养殖模式不断发展,随之而来的就是水产动物抗应激能力的逐渐下降,从而导致水产病害种类也逐渐增加。通过给鱼体补充一些功能性营养物质,提高机体氧化应激能力,增强机体免疫力已成为近年来的研... 详细信息

近年来水产养殖规模不断扩大,高密度集约化养殖模式不断发展,随之而来的就是水产动物抗应激能力的逐渐下降,从而导致水产病害种类也逐渐增加。通过给鱼体补充一些功能性营养物质,提高机体氧化应激能力,增强机体免疫力已成为近年来的研究热点。已证实硒在水产动物中有提高免疫力,增强其生长性能的作用,是一种应用前景良好的水产饲料添加剂。由于高密度集约化养殖模式会大大增加养殖水体的亚硝酸盐浓度,本研究以草鱼肝、肾细胞为研究对象,初步探讨在亚硝酸钠的暴露下,补充适量硒元素对细胞抗氧化、抗凋亡能力的影响及胞内相关的响应机制,主要研究结果如下:1、在草鱼肝细胞实验中,通过CCK8细胞活力检测,筛选出亚硒酸钠孵育浓度为10μmol/L,孵育时间为12h;亚硝酸钠孵育浓度为5、10、25mg/L,孵育时间为24h。设置对照组、亚硝酸钠暴露实验组、亚硒酸钠孵育实验组和亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组。结果显示,亚硝酸钠暴露能抑制草鱼肝细胞贴壁,阻碍细胞生长,诱导细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低;gpx、sod和cat基因表达下调（P＜0.05）,CHOP（又称DNA损伤诱导基因153（GADDl53））和bcl-2相关X蛋白（bax）基因表达上调（P＜0.05）,流式细胞术结果显示细胞凋亡率显著上升（P＜0.05）,且主要集中在晚期凋亡。亚硒酸钠（10μmol/L）单独孵育对细胞形态和凋亡率无显著影响,但GPX、SOD和CAT活性上升（P＜0.05）,且gpx、sod、cat、核因子E2相关因子2（Nrf2）和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（keap1）基因表达上调（P＜0.05）。在亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组中,细胞能正常生长,细胞凋亡率显著下降,较对照组无显著性差异（P＞0.05）、GPX、SOD和CAT活性恢复至正常水平,较对照组无显著变化（P＞0.05）,gpx、sod和cat基因表达下调至正常水平（P＞0.05）,B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）基因表达显著上调（P＜0.05）。2、在草鱼肾细胞实验中,通过CCK8细胞活力检测,筛选出亚硒酸钠孵育浓度为10μmol/L,孵育时间为12h;亚硝酸钠孵育浓度为25mg/L,孵育时间为24h。同样设置对照组、亚硝酸钠暴露实验组、亚硒酸钠孵育实验组和亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组。结果显示,硒的预孵育作用能缓解亚硝酸钠暴露导致的草鱼肾细胞内GPX、SOD和CAT的活性降低,在亚硝酸钠暴露组中,gpx、sod和cat基因显著下调（P＜0.05）,chop和bax基因显著上调（P＜0.05）,流式细胞术显示细胞凋亡率显著上升,与草鱼肝细胞结果一致。其中,胞内钙离子浓度显著升高,且随着亚硝酸钠浓度增加而增加,在BHQ抑制剂孵育后,胞内钙离子浓度降低。在亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组中,相关抗氧化酶基因和凋亡相关基因表达均能维持在正常水平,胞内钙离子浓度与对照组无显著性差异（P＞0.05）。3、综上所述,草鱼肝、肾细胞经亚硒酸钠预孵育后,能有效缓解亚硝酸钠暴露带来的氧化损伤,降低细胞凋亡率,维持细胞的正常生长;在基因方面,细胞在吸收硒元素后能上调抗氧化基因和Nrf2-keap1通路上关键基因,提示硒孵育的保护作用可能是通过Nrf2-keap1通路来实现的。在肾细胞中,硒的预孵育可以缓解胞内内质网钙离子紊乱,说明在降低细胞凋亡率方面,可能与缓解胞内钙离子紊乱有关。

关键词：草鱼肝肾细胞亚硒酸钠亚硝酸钠抗氧化细胞凋亡 Nrf2-keap1通路

水蕹菜和水芹菜鱼菜共生系统中水质和微生物组成特征研究

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水蕹菜和水芹菜鱼菜共生系统中水质和微生物组成特征研究

作者：杨东烨华中农业大学

学位级别：硕士

鱼菜共生技术是将水产养殖和水培植物种植相结合的现代生态养殖技术,与单一的水产养殖相比较能够将物质有效循环利用,达到净化水质、减少病害、提升品质、渔民增收的效果。其技术原理为通过系统内水培植物根系所富集微生物的分解作用将... 详细信息

鱼菜共生技术是将水产养殖和水培植物种植相结合的现代生态养殖技术,与单一的水产养殖相比较能够将物质有效循环利用,达到净化水质、减少病害、提升品质、渔民增收的效果。其技术原理为通过系统内水培植物根系所富集微生物的分解作用将养殖尾水中富营养物质转化为可供植物生长利用的养分实现资源的循环利用。本试验探究了水培植物水蕹菜和水芹菜两种不同水培植物在水质净化应用效果及根系微生物组成方面的研究,并应用于耦合型鱼菜共生系统中,通过对水质净化结果和微生物组成的研究对比来分析两种水培植物在鱼菜共生系统中的差异。本研究的主要研究结果如下:1、水培植物试验分为单一水蕹组、单一水芹组、水蕹水芹混合组三种处理。试验结果表明,在30 d的水培试验中,单一水蕹组在前期对于系统内的含氮营养盐去除率高于水芹组,但后期去除率低于水芹组,随植物生长的逐步稳定,水芹组对于含氮营养盐的去除率逐步升高,试验结束后水芹组对于氨氮的去除率达到80.59%,对于亚硝酸盐氮的去除率达到99.73%,对于硝酸盐氮的去除率达到73.44%,显著优于水蕹组(P<0.05);水蕹组对于氨氮的去除率为54.88%,对于亚硝酸盐氮的去除率为95.18%,对于硝酸盐的去除率为62.39%。混合组的去除效率处于单一水芹组和单一水蕹组之间。对于含磷营养盐的去除,初始浓度为10 mg/L,试验结束时,水蕹组可溶性磷含量为3.67 mg/L,水芹组为4.72 mg/L,混合组为4.29 mg/L,水蕹组对于磷盐的去除效果显著高于水芹组和混合组(P<0.05)。在对植物根系样品进行微生物组16S r RNA测序后发现在属水平上样本中前十的优势微生物物种均为黄杆菌属(Flavobacterium)、食氢菌属(Hydrogenophaga)、食酸菌属(Acidovorax)、细胞弧菌属(Cellvibrio)、幽门螺杆菌属(Phreatobacter)、叶绿体(Chloroplast)、根瘤菌属(Rhizobacter)、异根瘤菌属(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)、JCM菌属(Noviherbaspirillum)和红育菌属(Rhodoferax)。水芹根系黄杆菌属占比显著高于水蕹根系(P<0.05),水蕹根部微生物中最优势菌种为食氢菌属,占比为12.86%,混合组和水芹组最优势菌种皆为黄杆菌属,其中单一水芹组占比比混合组更高(17.55%)。在物种丰度方面,混合组显著高于单一组(P<0.05),通过Alpha多样性分析在局部均匀生境下混合组的物种丰度显著上调,其覆盖度和多样性均有上升。2、养殖试验分为水蕹组,水芹菜组和空白组三组,在30 d鱼菜共生系统试验中,水蕹组溶氧波动水平最小,p H值无显著差异,日温度波动空白组变化幅度最大,水芹菜组和水蕹组没有显著性差异。在水质理化指标方面,整体含氮营养盐的浓度变化基本呈现先上升后逐渐下降的趋势,其中试验组含量显著低于空白组。试验结束时,水蕹组总氮含量维持在6.54 mg/L、水芹菜组为5.16 mg/L、空白组为7.47 mg/L。试验期间系统内水体含磷营养盐浓度变化在试验过程中呈现逐步上升趋势并最终达到最大浓度,其中空白组磷盐含量浓度最高;在试验结束时,水蕹菜组总磷含量最高为4.37 mg/L、水芹菜组最高为3.64 mg/L、空白组最高为6.08 mg/L。试验组总氮的去除率在1.34%～38.70%之间,水芹菜组的总氮去除率略高于水蕹菜组,空白组则不具有去除效果。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率在5%～50%的范围内波动,亚硝酸盐氮的去除效果优于氨氮的去除效果,亚硝酸盐氮最佳去除率为水芹组59.62%。水蕹菜组具有最高的含磷营养盐的去除率为37.58%,其可溶性磷去除效果优于水芹菜组,而且较为稳定。系统内异育银鲫(Carassius auratus gibelio *** V)生长状况和摄食状况良好,水芹组增重率显著高于水蕹组和空白组(P<0.05),体重初始为12.22±0.66 g,终末体重18.97±1.64 g,增重率为56.29%,且特定生长率、肥满度均优于空白组和水蕹组。对植物根系样品和水体样本进行微生物组16S r RNA测序,属水平上样本中前十的优势微生物物种为多核杆菌属(Polynucleobacter)、鲸蜡杆菌属(Cetobacterium)、幽门螺杆菌属(Phreatobacter)、食氢菌属(Hydrogenophaga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、栖湖菌属(Limnohabitans)、黄杆菌属(Flavobacterium)、糖单胞菌属(Saccharimonadales)、新鞘脂菌属(Novosphingobium)、宝石杆菌属(Gemmo

关键词：鱼菜共生水蕹菜水芹菜微生物组水质净化

两种投喂方式下中华绒螯蟹生长、肌肉组织特性和营养成分的差异研究

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两种投喂方式下中华绒螯蟹生长、肌肉组织特性和营养成分的差异研...

作者：陆正一华中农业大学

学位级别：硕士

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis,又名河蟹)是中国重要且特有的淡水经济动物,其营养丰富,滋味鲜美,深受消费者的喜爱。湖北地处长江流域中游,环境气候适宜中华绒螯蟹生长,目前本地化养殖中华绒螯蟹的生长规律、营养需求以及育肥技术等基... 详细信息

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis,又名河蟹)是中国重要且特有的淡水经济动物,其营养丰富,滋味鲜美,深受消费者的喜爱。湖北地处长江流域中游,环境气候适宜中华绒螯蟹生长,目前本地化养殖中华绒螯蟹的生长规律、营养需求以及育肥技术等基础信息相对有限。中华绒螯蟹饵料以豆粕、玉米和冰鲜鱼等天然的饲料原料为主,投喂模式尚未完全标准化,同时商品饲料质量参差不齐,没有系统广泛地应用于生产。为了探究天然饵料和配合饲料对育肥期中华绒螯蟹生长生理、肌肉组织特性和营养成分等方面的影响,本研究以5至10月中华绒螯蟹为实验对象,在两个相邻的独立池塘中分别使用天然饵料(豆粕:玉米:小麦:海产冰鲜鱼=2:3:2:1,粗蛋白:粗脂肪=5:1)和配合饲料(粗蛋白:粗脂肪=5:1)进行养殖实验,对其生长规律、抗氧化能力、肌肉结构和营养成分等方面的指标进行比较,得到以下研究结果:1.两种投喂方式下中华绒螯蟹的生长、成熟与抗氧化能力的差异天然饵料组雄蟹平均体重在初期较低,后期增重率较高,10月成熟期平均体重显著高于配合饲料组(P<0.05)。天然饵料组雄蟹性腺发育较晚,10月成熟期性腺指数(GSI)显著高于配合饲料组(P<0.05)。天然饵料组雌蟹性腺发育同样较晚,但发育速度更快,成熟期GSI与配合饲料组没有差异。天然饵料组投喂下雄蟹和雌蟹前3个月的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、谷丙转氨酶(ALT)活力和丙二醛(MDA)含量均显著高于配合饲料组(P<0.05),且CAT活力和MDA含量在养殖后期下降至没有差异性,T-SOD活力和ALT活力在10月成熟期下降至低于配合饲料组。本研究结果表明,配合饲料投喂下中华绒螯蟹早期增重率高,性腺发育早,养殖过程中血清抗氧化水平较低,氧化损伤较小。天然饵料投喂下中华绒螯蟹后期增重率高,性腺发育晚,成熟期雌蟹性腺系数更高,血清中抗氧化水平更高。2.两种投喂方式下中华绒螯蟹的肌肉组织特性的差异天然饵料组中华绒螯蟹雄蟹和雌蟹肌肉组织肌纤维直径在8月显著小于配合饲料组,而在10月成熟期显著大于配合饲料组(P<0.05)。雌蟹8月腹部肌、9月腹部肌和雄蟹9月腹部肌、步足肌4个实验组中,天然饵料组的肌纤维小片化指数都显著低于天然饵料组(P<0.05),而10月成熟期各种肌肉未出现两种投喂方式间的显著性差异。实验过程中总胶原蛋白含量、热熔性胶原蛋白含量和热残留胶原蛋白含量的结果中未出现两种投喂方式下的显著性差异。根据肌肉组织特性评价模型评价结果,在9月和10月,配合饲料组的肌肉嫩度优于天然饵料组。3.两种投喂方式下中华绒螯蟹的营养成分的差异雄蟹8～10月的肝胰腺组织中,配合饲料组的粗脂肪含量均高于天然饵料组,雌蟹肝胰腺组织中,天然饵料组粗脂肪含量在10月显著高于天然饵料组(P<0.05)。雄蟹肌肉组织中,8月天然饵料组总氨基酸含量(TAA)显著高于配合饲料组(P<0.05),8月和10月必需氨基酸含量(EAA)显著高于配合饲料组(P<0.05)。雌蟹肌肉组织中,8月和10月的天然饵料组TAA显著高于配合饲料组(P<0.05),8月的天然饵料组中EAA显著高于配合饲料组(P<0.05)。雄蟹各实验组必需氨基酸占总氨基酸的比例(NAA/TAA)范围为0.29～0.32,雌蟹则为0.32～0.35。肌肉组织脂肪酸结果中,雄蟹天然饵料组n-3不饱和脂肪酸含量在8月显著高于配合饲料组,同时期n-3/n-6显著高于配合饲料组(P<0.05)。天然饵料组二十碳五烯酸(EPA)含量在8月和9月显著高于配合饲料组(P<0.05),二十碳五烯酸与二十二碳六烯酸比值(EPA/DHA)因此低于配合饲料组。雌蟹天然饵料组n-3/n-6在各阶段显著高于配合饲料组(P<0.05),与雄蟹实验结果一致。肝胰腺组织脂肪酸结果中,雄性天然饵料组n-3不饱和脂肪酸含量在8月显著高于配合饲料组,n-3/n-6显著高于配合饲料组(P<0.05),EPA含量在8月和9月显著高于配合饲料组(P<0.05),EPA/DHA因此低于配合饲料组。雌蟹天然饵料组的n-6不饱和脂肪酸含量在8月和9月显著低于配合饲料组(P<0.05),同时期天然饵料组的n-3/n-6也显著高于配合饲料组(P<0.05)。雌蟹天然饵料组EPA/DHA始终低于配合饲料组,差异显著(P<0.05)。性腺组织脂肪酸结果中,成熟雄蟹天然饵料组的DHA显著高于配合饲料组,C18:1显著低于配合饲料组(P<0.05)。成熟雌蟹天然饵料组的饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)显著高于配合饲料组(P<0.05)。综上所述,天然饵料投喂下中华绒螯蟹在养殖后期增重率更高,性腺指数更高,肌肉TAA、EAA含量和n-3/n-6更高,雄蟹性腺中DHA含量更高,雌性性腺中PUFA含量更高。配合

关键词：中华绒螯蟹天然饵料配合饲料生长脂肪酸分析肌肉组织特性

饲料硒添加对草鱼生长调控及镉毒性的拮抗作用研究

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饲料硒添加对草鱼生长调控及镉毒性的拮抗作用研究

作者：马聘华中农业大学

学位级别：硕士

硒(Selenium,Se)是水产动物生长所必需的矿物质元素,补硒可以促进动物生长,增强抗氧化能力,以及拮抗重金属毒性等。硒主要通过合成硒蛋白来发挥其生物学活性。脱碘酶(DIO)是一类重要的硒蛋白,它的主要功能是催化甲状腺素(T4)脱碘形成三... 详细信息

硒(Selenium,Se)是水产动物生长所必需的矿物质元素,补硒可以促进动物生长,增强抗氧化能力,以及拮抗重金属毒性等。硒主要通过合成硒蛋白来发挥其生物学活性。脱碘酶(DIO)是一类重要的硒蛋白,它的主要功能是催化甲状腺素(T4)脱碘形成三碘甲状腺原氨酸(T3)。已有研究表明,补硒会增强DIO的活性,调节机体甲状腺激素(TH)的水平。镉(Cadmium,Cd)是一种危害性极强的重金属污染物,有研究表明,硒可以通过清除动物体内的自由基,修复抗氧化系统,并且硒蛋白可以与重金属镉结合形成惰性复合物来减轻其毒性。为了进一步探究补硒对鱼类生长以及甲状腺激素代谢的影响和补充饲料硒对鱼类拮抗镉毒性的作用,本研究以草鱼为试验对象,将180尾健康草鱼分为3组,分别饲喂含硒0.141、0.562和1.044 mg/kg的饲料60天,研究补硒对草鱼生长、下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴、生长激素-胰岛素样生长因子(GH-IGF)轴的影响。同时在饲料硒投喂试验结束后对草鱼进行了急性镉胁迫试验,通过测量分析草鱼肝脏中丙二醛(MDA)含量,抗氧化酶活性,重金属清除基因以及细胞凋亡相关基因的相对转录水平来评估膳食硒对重金属毒性的拮抗作用。研究结果如下:1.饲料中添加硒可以提高草鱼的增重和特定生长率,补硒组草鱼肝脏中三种DIO的活性显著高于对照缺硒组。两个补硒组草鱼血清中促甲状腺激素(TSH)、T3和游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)的水平均显著提高,同时T4和游离甲状腺素(FT4)的含量显著降低。甲状腺组织学观察表明缺硒会导致甲状腺滤泡上皮细胞肥大,胶质空泡化。此外,随着日粮硒浓度的增加,dio1、dio2和dio3的相对转录水平呈上升趋势。HPT轴相关基因(crh、tsh-β、ttr、tr-s、tpo、nis)和GH/IGF1相关基因(gh、ghr、igf1、igf1r)的相对转录水平在补硒组显著上调。除了T3含量和dio1的相对转录水平外,上述指标在0.562 mg Se/kg组与1.044 mg Se/kg组之间均无显著差异。结果提示,补充日粮硒促进了草鱼肝脏中DIO活性和甲状腺激素代谢,调节了HPT轴和GH/IGF-1轴相关基因的转录水平,这些可能是促进草鱼生长的重要因素。2.经水体镉急性暴露后,补硒组草鱼肝脏中MDA含量与对照缺硒组相比显著减少。GSH-Px、CAT和SOD的活性随着镉胁迫时间增长呈现出先上升后减弱的趋势,此外,补硒组GSH-Px的活性显著高于对照缺硒组。1.044 mg Se/kg组草鱼肝脏中重金属清除基因abcc2的相对转录水平显著低于0.562 mg Se/kg组和对照组。0.562 mg Se/kg与1.044 mg Se/kg组草鱼肝脏中重金属消除基因mt2的相对转录水平显著低于对照组。镉诱导草鱼肝脏中凋亡相关因子jnk和bax的表达,凋亡信号基因caspase3、caspase8、caspase9的相对转录水平在镉暴露后显著升高。组间比较发现,补硒可以通过下调jnk、bax、caspase3、caspase8、caspase9基因的相对表达水平,上调抗凋亡基因bcl-2来抑制重金属镉诱导的细胞凋亡。TUNEL检测结果发现,补硒组草鱼肝脏细胞的凋亡指数显著低于对照组。综合分析,补充饲料硒可以通过提升GSH-Px的活性有效减轻重金属镉引起的过氧化损伤,并且可以抑制JNK-Caspase途径来减轻镉引起的肝脏细胞凋亡。

关键词：草鱼酵母硒镉 HPT轴 GH/IGF轴细胞凋亡

亚硝酸盐急性胁迫对草鱼内质网应激PERK通路的影响

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亚硝酸盐急性胁迫对草鱼内质网应激PERK通路的影响

作者：谢丽霞华中农业大学

学位级别：硕士

草鱼是我国一种重要的淡水养殖鱼类,多年来在全国淡水养殖鱼类总产量中排名第一,亚硝酸盐是生态系统氮循环中的一种重要中间产物,可污染养殖水,水体中产生过多的亚硝酸盐会使鱼体中毒甚至死亡。亚硝酸盐可引起鱼类的应激,内质网应激是... 详细信息

草鱼是我国一种重要的淡水养殖鱼类,多年来在全国淡水养殖鱼类总产量中排名第一,亚硝酸盐是生态系统氮循环中的一种重要中间产物,可污染养殖水,水体中产生过多的亚硝酸盐会使鱼体中毒甚至死亡。亚硝酸盐可引起鱼类的应激,内质网应激是一种常见的应激反应,其中的PERK通路对细胞抵御环境刺激起着重要的作用。本研究探讨了急性亚硝酸盐暴露对草鱼及其分离细胞的内质网应激、抗氧化、血液生化、细胞活力和凋亡等方面的影响,旨在为控制养殖水体中亚硝酸盐浓度提供理论基础。急性攻毒实验选取体格健康的1龄草鱼(37.21±0.30 g),分别暴露于0 mg/L、8 mg/L、13 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的亚硝酸盐溶液中0 h、12 h、24 h、48 h、96 h后,收集鳃、肝脏、肌肉、血液等样品,检测草鱼肝脏和肌肉中grp78、perk、eif-2α、atf4、chop、bax、bcl-2基因的表达,观察草鱼肝脏、鳃的组织学结构,检测草鱼血液中的生理生化指标和抗氧化酶活性。体外实验以草鱼离体肝细胞(L8824)、肾细胞(CIK)为材料,将L8824细胞暴露于不同浓度的亚硝酸盐溶液后,检测细胞活力、内质网应激相关基因grp78、perk、eif-2α、atf4、chop、凋亡相关基因bax、bcl-2的表达、细胞凋亡、形态变化和细胞内[Ca]信号的变化。将CIK细胞暴露于不同浓度的亚硝酸盐溶液后,检测细胞活力、细胞凋亡率、细胞形态以及相关基因表达的变化。主要研究结果如下:1.对照组草鱼的肝脏中,肝细胞排列整齐,细胞核位置明显,位于中心,50 mg/L亚硝酸盐暴露96 h后,草鱼肝脏组织结构受损,细胞核位置发生明显的偏移,肝细胞排列紊乱,空泡化现象严重;对照组鳃丝和鳃小片排列整齐,紧密有序,50 mg/L亚硝酸盐暴露96 h后,鳃小片排列紊乱,毛细血管扩张、肿大。不同浓度亚硝酸盐作用后,草鱼血清中过氧化氢酶(CAT)的活性先显著升高后降低,随着暴露时间的延长,血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性在8 mg/L、13 mg/L、25 mg/L、50 mg/L组中逐渐降低。高浓度的亚硝酸盐持续暴露12 h、24 h、48 h、96 h后,草鱼血液中谷丙转氨酶(ALT)的活性显著升高,持续12 h、24 h、48 h后,碱性磷酸酶(AKP)含量升高,胆固醇(CHO)含量显著上升,48 h后谷草转氨酶(AST)的含量先升高后降低,葡萄糖(GLU)、白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)和甘油三酯(TG)的含量有所升高但无显著变化。PERK通路的基因在草鱼中具有组织表达差异性,与肝脏相比,perk和atf4在肌肉中的表达较低,在其他组织中的含量较高;eif-2α在肌肉和肾脏中的表达较低,在其他组织中表达较高;chop在肠道和鳃中表达较高,在其余组织中的表达较低。亚硝酸盐急性暴露后,草鱼肝脏中内质网应激标记物grp78的表达水平在处理组显著上调,PERK通路相关基因perk、eif-2α、atf4、chop的含量先上升后下降,促凋亡基因bax的表达显著上调,抑制凋亡基因bcl-2的表达显著下调,因此bax/bcl-2的比值显著升高。在草鱼肌肉中,grp78的表达先升高后降低,8 mg/L亚硝酸盐暴露24 h后,perk、eif-2α、atf4、chop的表达先显著上升后下降,bax在肌肉中的表达先升高后降低,bcl-2的表达显著降低。2.亚硝酸盐暴露草鱼离体肝细胞L8824不同时间后,细胞活力随浓度的升高显著降低;作用12 h、24 h后细胞凋亡率随浓度的增加显著升高,在100 mg/L组中,细胞形态出现明显的凋亡迹象,细胞核收缩;胞内[Ca]荧光强度以时间和浓度依赖性方式升高,添加Ca释放通道IP3R的拮抗剂2-APB后,细胞内[Ca]信号有所降低;grp78的表达显著升高,perk和eif-2α的表达量在10 mg/L组显著升高,atf4的表达水平无显著变化,chop在10 mg/L、100 mg/L组显著升高,bax在10 mg/L组中显著升高,bcl-2在2.5 mg/L组中显著降低,在10 mg/L、100 mg/L组低于对照组;与10 mg/L亚硝酸盐单独作用相比,添加PERK通路抑制剂GSK2656157后细胞凋亡率显著降低。3.亚硝酸盐作用不同时间后,草鱼离体肾细胞CIK的细胞活力随浓度升高而显著降低,PERK通路基因perk、eif-2α、atf4的表达无显著变化,在处理组中,chop基因的表达显著增加,bax的表达显著升高,凋亡基因bcl-2的抑制作用被显著降低,bax/bcl-2的比值增加,亚硝酸盐作用24 h后细胞凋亡率显著升高,在高浓度组中细胞形态出现明显的凋亡迹象。综上所述,高浓度的亚硝酸盐急性应激能够致使草鱼发生内质网应激反应,激活未

关键词：亚硝酸盐草鱼内质网应激细胞活力细胞凋亡 PERK通路