硒对亚硝酸钠引致的草鱼肝肾细胞损伤的保护作用研究

作     者：姚朝瑞 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汤蓉

授予年度：2020年

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：草鱼肝肾细胞 亚硒酸钠 亚硝酸钠 抗氧化 细胞凋亡 Nrf2-keap1通路 

摘      要：近年来水产养殖规模不断扩大,高密度集约化养殖模式不断发展,随之而来的就是水产动物抗应激能力的逐渐下降,从而导致水产病害种类也逐渐增加。通过给鱼体补充一些功能性营养物质,提高机体氧化应激能力,增强机体免疫力已成为近年来的研究热点。已证实硒在水产动物中有提高免疫力,增强其生长性能的作用,是一种应用前景良好的水产饲料添加剂。由于高密度集约化养殖模式会大大增加养殖水体的亚硝酸盐浓度,本研究以草鱼肝、肾细胞为研究对象,初步探讨在亚硝酸钠的暴露下,补充适量硒元素对细胞抗氧化、抗凋亡能力的影响及胞内相关的响应机制,主要研究结果如下:1、在草鱼肝细胞实验中,通过CCK8细胞活力检测,筛选出亚硒酸钠孵育浓度为10μmol/L,孵育时间为12h;亚硝酸钠孵育浓度为5、10、25mg/L,孵育时间为24h。设置对照组、亚硝酸钠暴露实验组、亚硒酸钠孵育实验组和亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组。结果显示,亚硝酸钠暴露能抑制草鱼肝细胞贴壁,阻碍细胞生长,诱导细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低;gpx、sod和cat基因表达下调（P0.05）,CHOP（又称DNA损伤诱导基因153（GADDl53））和bcl-2相关X蛋白（bax）基因表达上调（P0.05）,流式细胞术结果显示细胞凋亡率显著上升（P0.05）,且主要集中在晚期凋亡。亚硒酸钠（10μmol/L）单独孵育对细胞形态和凋亡率无显著影响,但GPX、SOD和CAT活性上升（P0.05）,且gpx、sod、cat、核因子E2相关因子2（Nrf2）和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（keap1）基因表达上调（P0.05）。在亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组中,细胞能正常生长,细胞凋亡率显著下降,较对照组无显著性差异（P0.05）、GPX、SOD和CAT活性恢复至正常水平,较对照组无显著变化（P0.05）,gpx、sod和cat基因表达下调至正常水平（P0.05）,B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）基因表达显著上调（P0.05）。2、在草鱼肾细胞实验中,通过CCK8细胞活力检测,筛选出亚硒酸钠孵育浓度为10μmol/L,孵育时间为12h;亚硝酸钠孵育浓度为25mg/L,孵育时间为24h。同样设置对照组、亚硝酸钠暴露实验组、亚硒酸钠孵育实验组和亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组。结果显示,硒的预孵育作用能缓解亚硝酸钠暴露导致的草鱼肾细胞内GPX、SOD和CAT的活性降低,在亚硝酸钠暴露组中,gpx、sod和cat基因显著下调（P0.05）,chop和bax基因显著上调（P0.05）,流式细胞术显示细胞凋亡率显著上升,与草鱼肝细胞结果一致。其中,胞内钙离子浓度显著升高,且随着亚硝酸钠浓度增加而增加,在BHQ抑制剂孵育后,胞内钙离子浓度降低。在亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组中,相关抗氧化酶基因和凋亡相关基因表达均能维持在正常水平,胞内钙离子浓度与对照组无显著性差异（P0.05）。3、综上所述,草鱼肝、肾细胞经亚硒酸钠预孵育后,能有效缓解亚硝酸钠暴露带来的氧化损伤,降低细胞凋亡率,维持细胞的正常生长;在基因方面,细胞在吸收硒元素后能上调抗氧化基因和Nrf2-keap1通路上关键基因,提示硒孵育的保护作用可能是通过Nrf2-keap1通路来实现的。在肾细胞中,硒的预孵育可以缓解胞内内质网钙离子紊乱,说明在降低细胞凋亡率方面,可能与缓解胞内钙离子紊乱有关。